Allotransplantasi Ovarium Mencit Baru Lahir ke Mencit Dewasa: Pengaruhnya terhadap Siklus Estrus Resipien dan Morfologi Ovarium Donor

(ALLOGRAFT OF NEWBORN MICE OVARY INTO ADULT RECIPIENT: THEIR EFFECT OF OESTROUS CYCLES OF RECIPIENT AND MORPHOLOGY OF DONOR OVARY)

Herisman Hernadi, Kusdiantoro Mohamad*, Ita Djuwita
Lab. Embriologi, Departemen Anatomi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor,
Jl. Agatis Kampus IPB Dramaga, Bogor, 16680.
Telp/Fax: 0251-421823 . *Korespondensi: E-mail: [email protected]
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberhasilan allotransplantasi ovarium mencit yang baru lahir ke mencit dewasa ditinjau dari siklus estrus dan bobot uterus resipien, serta pertumbuhan dan morfologi ovarium donor. Mencit betina strain DDY berumur satu hari (baru lahir) bertindak sebagai donor ovarium dan mencit betina berumur tiga bulan sebagai resipien. Perlakuan terdiri dari tiga kelompok, yaitu allotransplantasi ovarium donor dengan dan tanpa bursa ovari, serta autotransplantasi (kontrol), masing-masing sebanyak sembilan ekor. Transplantasi dilakukan pada subkapsula ginjal. Siklus estrus diamati setiap hari dan pada hari ke-30 pascatransplantasi mencit dimatikan, bobot uterus resipien ditimbang, pertumbuhan ovarium donor diamati secara makroskopis dan mikroskopis. Tidak terdapat perbedaan yang nyata antara jumlah resipien yang bersiklus, rataan panjang siklus estrus dan bobot uterus pada allotransplantasi dengan dan tanpa bursa ovari, tetapi kedua kelompok berbeda dibandingkan dengan autotransplantasi (P

Kata Kunci: allotransplantasi, ovarium, mencit baru lahir, histologi

ABSTRACT
The aim of this research was to study allograft of newborn mice ovary with and without bursa ovarii into adult recipient with special references on oestrous cycle and uterine weight of recipient, and development and morphology of donor ovary. Thirty five newborn DDY mice ovaries used as donor and 27 female DDY mice aged 3-4 months used as recipient were divided into three groups: allograft of donor ovary with bursa and without bursa, and autograft (control). Ovaries were grafted under the kidney capsule of the recipients. Oestrous cycles were examined daily and on day-30 all recipients were sacrificed. Uterine tissues were weighted and ovarian tissues were fixed for histologycal examination. There was no significant difference on number of recipient which oestrous cycle, length of estrous cycles and uterine weight in allograft with and without bursa groups, but those in these groups were significantly different with autograft group (P

Key words: Allograft, ovary, newborn mice, histology

PENDAHULUAN
Transplantasi ovarium telah dilakukan pada hewan maupun manusia. Pada hewan, teknik transplantasi ovarium digunakan untuk menumbuhkan jaringan ovarium secara in vivo dan dikombinasikan dengan teknik produksi embrio secara in vitro dalam rangka penelitian ke arah konservasi satwa langka (Shaw et al., 2000; Liu et al., 2000; Snow et al., 2002). Pada manusia, teknik transplantasi digunakan pada pasien wanita penderita kanker untuk menghindarkan ovarium dari efek terapi radiologi dan kimiawi dengan cara memindahkannya ke daerah yang lebih aman, sehingga setelah terapi selesai dapat ditransplantasikan ke tempat semula (Newton, 1998; Oktay et al., 1998, 2003). Selain itu, teknik tranplantasi ovarium menunjang program bank gamet yang memungkinkan ovarium yang telah disimpan dalam bentuk beku dapat digunakan kembali dengan cara ditransplantasikan kembali kepada individu yang sama atau kepada hewan laboratorium yang imunodefisiensi (Gunasena et al., 1997, 1998; Sztein et al., 1998).
Penelitian mengenai transplantasi ovarium telah banyak dilakukan, baik menggunakan jaringan ovarium yang telah dewasa, yang baru lahir, maupun fetus (Cox et al., 1994, Liu et al., 2002). Transplantasi ovarium juga telah dilaporkan pada individu yang sama, pada individu dalam satu spesies maupun beda species (Corleta et al., 1998; Gunasena et al., 1997). Pada allo- dan xeno-transplantasi yang telah dilaporkan, semua menggunakan hewan strain khusus yang imunodefisiensi seperti mencit severe combined immunodeficiency/SCID, (Gosden et al., 1994), mencit tanpa thymus (Gunasena et al., 1997) dan tikus nude (Snow et al., 2002) dengan keberhasilan perkembangan folikel setelah transplan tanpa terjadi reaksi imunologis atau penolakan jaringan. Namun sampai saat ini belum pernah dilaporkan hasil penelitian yang menggunakan hewan yang non immunodefisiensi sebagai hewan percobaan pada penelitian allotransplantasi ovarium. Selain itu, belum pernah dilaporkan penelitian allotransplantasi ovarium yang membandingkan secara khusus mengenai efek keberadaan bursa ovari terhadap keberhasilan transplantasi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perkembangan allotransplantasi ovarium mencit yang baru lahir dengan dan tanpa bursa ovari pada subkapsular ginjal mencit betina dewasa ditinjau dari siklus estrus dan bobot uterus mencit resipien serta pertumbuhan dan morfologi ovarium donor setelah transplantasi.

MATERI DAN METODE
Hewan Percobaan
Penelitian ini menggunakan 18 ekor mencit betina strain DDY yang berumur satu hari (baru lahir) sebagai sumber ovarium (donor) dan 27 ekor mencit betina dewasa dengan umur tiga bulan sebagai resipien dan kontrol. Mencit dipelihara pada kondisi siklus gelap:terang = 12:12 jam dan diberi pakan dan minum ad libitum.
Prosedur penelitian
Mencit donor berumur satu hari dibunuh dengan cara dekapitasi, rongga perut dibuka dan ovarium diambil menggunakan pinset halus. Karena sangat kecil, ovarium umur satu hari dapat diidentifikasi dengan warna putih susu, terletak tepat di lateral ginjal. Cara lain menemukan lokasi ovarium adalah menelusurinya dari kornua uteri ke arah ginjal dan ovarium terletak di ujung dari kornua uteri. Setelah diambil, ovarium donor ditaruh di dalam larutan NaCl fisiologis dingin sampai dilakukan transplantasi. Ovarium dibagi dalam dua kelompok, sebagian dibiarkan tetap memiliki bursa ovari (kelompok dengan bursa, 17 ovarium, satu ovarium hilang saat pengerjaan) sedangkan sebagian lagi dibersihkan dari bursa ovari (kelompok tanpa bursa, 18 ovarium). Penghilangan bursa ovari dilakukan menggunakan jarum 27 G dengan pengerjaan di bawah pengamatan mikroskop inverted dengan pembesaran empat kali.
Mencit resipien terdiri dari sembilan ekor menerima allotransplantasi ovarium dengan bursa, sembilan ekor menerima allotransplantasi ovarium tanpa bursa, dan sembilan ekor menerima autotransplantasi ovariumnya sendiri (kontrol). Sebelum transplantasi, mencit resipien dibius dengan menggunakan 0,3 mg xylazine (0,02 ml) secara intraperitoneal dan 1,5 mg ketamin (0,02 ml) secara intra muskular. Transplantasi ovarium di subkapsula ginjal dilakukan seperti yang telah dilaporkan oleh penulis sebelumnya (Mohamad et al., 2004). Secara ringkas, ovarium resipien diambil melalui bidang sayatan di daerah punggung, kemudian ginjal dikeluarkan dengan cara menekan perut bagian ventral sampai ginjal keluar melalui bidang sayatan. Setelah ginjal berada di luar, kapsula ginjal dicubit dan dibuat sayatan tanpa melukai korteks ginjal, lalu ovarium donor yang telah disiapkan atau ovariumnya sendiri (kelompok kontrol) disisipkan ke bawah kapsula ginjal menggunakan pinset halus melalui bidang sayatan. Ovarium didorong menjauhi bidang sayatan agar tidak lepas keluar dari kapsula. Setelah itu, ginjal dikembalikan ke dalam rongga abdomen. Hal yang sama dilakukan pada ovarium dan ginjal yang satunya. Setelah selesai, kulit daerah punggung dijahit dan diberi antibiotik untuk persembuhan.
Evaluasi
Mencit diulas vaginanya setiap hari mulai hari ketujuh sampai hari ke-30 pascatransplantasi. Penentuan fase siklus estrus dilakukan berdasarkan perubahan sitologi hasil ulasan vagina (Mohamad et al., 2003). Pada hari ke-30 pascatransplantasi, mencit resipien dibius dan dimatikan. Rongga abdomen dibuka dan keberadaan ovarium di ginjal diperiksa secara makroskopis. Ovarium dinyatakan tumbuh jika terdapat jaringan ovarium yang lebih besar daripada ukuran saat ditransplan dengan warna putih susu berbeda dari warna ginjal yang merah kehitaman. Ovarium dinyatakan tidak tumbuh jika tidak ditemukan jaringan ovarium seperti gambaran di atas atau hanya terdapat sisa jaringan parut. Selanjutnya, ovarium beserta ginjal diambil dan difiksasi dalam larutan Bouin selama 24 jam, didehidrasi dalam alkohol, dijernihkan dalam xylol, dan ditanam dalam parafin. Jaringan disayat secara serial dengan ketebalan 5 m. Preparat dideparafinisasi, direhidrasi, dan diwarnai dengan hematoksilin eosin (HE). Pengamatan morfologi dan jumlah folikel dilakukan menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran objektif 400 kali.
Uterus dipreparir dan dipotong mulai dari pangkal serviks sampai ke unjung atas kornua uteri. Uterus dibersihkan dan dicuci dalam NaCl fisiologis lalu ditimbang untuk mengetahui bobotnya.

Analisis Data
Penelitian ini menggunkan rancangan acak lengkap. Data jumlah hewan bersiklus dan ovarium yang tumbuh secara makroskopis dan mikroskopis dianalisis dengan uji Kruskal Wallis. Data rataan panjang siklus estrus dan bobot uterus dianalisa dengan uji ANOVA, kemudian dilanjutkan dengan uji Duncan. Semua analisis menggunakan selang kepercayaan 95 % (α = 0,05).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Siklus Estrus dan Bobot Uterus Resipien
Tidak semua mencit resipien yang mendapat allotransplantasi ovarium donor mampu menunjukkan siklus normal, yaitu 22% dan 44 % mencit dengan rataan panjang siklus estrus 4,50 ± 2,12 dan 8,86 ± 4,49 hari, masing-masing untuk kelompok dengan dan tanpa bursa. Sebaliknya semua mencit kontrol yang mendapat autotransplantasi menunjukkan siklus estrus normal dengan panjang siklus rata-rata 5,28 ± 0,62 hari (Tabel 1).
Tabel 1. Jumlah mencit resipien dengan siklus estrus normal dan rataan panjang siklus estrus
Kelompok (-transplantasi)
Jumlah Resipien dengan
Siklus Estrus Normal (%)
Rataan panjang
siklus estrus (hari)
Dengan Bursa (allo-)
2 (22)a
4,50  2,12a
Tanpa Bursa (allo-)
4 (44)a
8,86  4,49b
Kontrol (auto-)
9 (100)b
5,28 ± 0,62ab
Ket: Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P

Gambaran siklus estrus sangat berkaitan erat dengan produksi hormon estrogen (Fox dan Laird, 1970). Estrogen yang tinggi pada saat estrus mengakibatkan penebalan dinding vagina dan mengakibatkan sel-sel superfisial mengalami pertandukan dan terlepas dari dinding epitel vagina. Akibatnya gambaran estrus pada ulasan vagina didominasi oleh sel-sel superfisial yang mengalami pertandukan. Sebaliknya, pada saat produksi estrogen menurun pada fase metestrus dan diestrus, maka sel-sel superfisial yang mengalami pertandukan secara berangsur menghilang, sehingga gambaran epitel vagina saat metestrus ditandai mulai munculnya leukosit sebanding dengan sisa sel superfisial yang mengalami pertandukan dan saat diestrus didominasi sepenuhnya oleh leukosit. Pada saat proestrus, estrogen mulai diproduksi lagi seiring dengan perkembangan folikel di ovarium. Karena aktivitas estrogen menyebabkan proliferasi sel-sel epitel vagina, maka gambaran ulasan vagina pada fase ini ditandai dengan keberadaan sel-sel epitel berinti.
Bobot uterus mencit resipien yang tidak bersiklus tidak berbeda nyata antara allotransplantasi ovarium dengan dan tanpa bursa (Tabel 2). Hal ini menunjukkan ketiadaan hormon estrogen yang mampu memelihara bobot uterus. Bobot uterus mencit resipien yang bersiklus pada kedua kelompok perlakuan tidak berbeda nyata tetapi lebih berat dibandingkan dengan uterus resipien yang tidak bersiklus. Jika dibandingkan dengan kelompok kontrol yang mendapat autotransplantasi, kedua kelompok allotransplantasi memiliki bobot uterus yang lebih ringan meskipun secara statistik tidak berbeda nyata (Tabel 2). Hasil ini menunjukkan diproduksinya hormon estrogen oleh mencit resipien yang bersiklus pada kelompok allotransplantasi, meskipun ada kemungkinan kadarnya tidak sampai menyamai kelompok autotransplantasi.
Tabel 2. Rataan bobot uterus mencit resipien dengan ovarium yang dinyatakan tumbuh secara makroskopis
Kelompok (-transplantasi)
Resipien yang bersiklus normal
Resipien yang tidak bersiklus
n
Bobot uterus (mg)
n
Bobot uterus (mg)
Dengan Bursa (allo-)
2
104,7 ± 43,3a
7
51,4  22,9a
Tanpa Bursa (allo-)
4
86,9 ± 34,8ab
5
49,5  23,0a
Kontrol (auto-)
9
161,4 ± 36,1a
-
-
Ket: Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P

Pada uterus, estrogen menyebabkan proliferasi sel-sel endometrium, mempertahankan kontraktilitas serta merangsang pembentukan dan sekresi kelenjar uterus (Hafez dan Hafez, 2000). Kadar estrogen yang tinggi menyebabkan uterus mengalami hipertrofi sedangkan kadar estrogen yang rendah mengakibatkan atrofi. Pada mencit ovariektomi atau pada mencit transplantasi yang ovariumnya gagal tumbuh dan berkembang, maka estrogen tidak diproduksi sehingga siklus estrus tidak muncul dan bobot uterus lebih rendah dibandingkan hewan kontrol (Corleta et al., 1998; Mohamad et al., 2003).

Viabilitas dan Morfologi Ovarium Donor
Pengamatan makroskopis pada hari ke-30 pascatransplantasi menunjukkan ovarium donor tanpa bursa ovari lebih banyak yang bertahan hidup (61%) dibandingkan ovarium donor dengan bursa ovari (24%) meskipun hasil kedua kelompok perlakuan ini tetap lebih rendah dibandingkan kontrol autotransplantasi (100%) (P

Gambar 1. Histologi ovarium pasca transplantasi di subkapsula ginjal. A. Allotransplantasi ovarium donor dengan bursa, B. Allotransplantasi ovarium donor tanpa bursa, C. Autotransplantasi ovarium (kontrol). G = ginjal, F = folikel. Pembesaran 40 X
Pemeriksaan histologi dari keberadaan folikel yang sempat berkembang pada kelompok allotransplantasi menunjukkan jumlah yang sangat sedikit. Sebanyak tiga folikel primer dan 11 folikel sekunder ditemukan pada dua buah ovarium dari kelompok dengan bursa ovari. Sebanyak dua folikel primer, 21 folikel sekunder dan 11 folikel tersier ditemukan pada empat buah ovarium dari kelompok tanpa bursa ovari. Gambaran histologi pada kedua kelompok ovarium didominasi oleh keberadaan sel-sel radang, baik pada ovarium yang tidak terdapat perkembangan folikel maupun pada ovarium yang terdapat perkembangan folikel. Sel-sel radang yang dijumpai terdiri dari sebagian besar limfosit dengan sedikit netrofil dan makrofag (Gambar 2). Berbeda dengan kelompok allotransplantasi, pada kontrol autotransplantasi, ovarium menunjukkan keberadaan folikel dengan jumlah yang lebih banyak, yaitu dengan jumlah rata-rata per ovarium untuk folikel primordial 893  343, primer 285  147, sekunder 71  45 dan tersier 12  6.

Gambar 2. Histologi ovarium donor pasca allotransplantasi, A. dengan bursa, B. tanpa bursa. C. Sel-sel radang yang mendominasi jaringan ovarium, limfosit (tanda panah putih), makrofag/monosit (kepala panah putih), dan neutrofil (tanda panah hitam). Pembesaran A dan B = 40 X, C = 400 X.

Konfirmasi terhadap kemungkinan sejumlah folikel sempat berkembang pada awal masa transplantasi, sebelum reaksi penolakan terjadi, ditunjukkan oleh gambaran siklus estrus. Siklus estrus muncul pada sepertiga awal masa transplantasi kemudian menghilang di duapertiga akhir masa pengamatan pada sebagian besar mencit resipien pada kelompok allotransplantasi. Keberadaan sel radang yang hebat pada ovarium pada kedua kelompok perlakuan allotransplantasi serta hanya sedikit folikel yang tersisa pada hari ke-30 pascatransplantasi menunjukkan telah terjadi reaksi penolakan meskipun kapan mulai terjadinya proses penolakan tidak dapat diketahui.
Ovarium donor pada kelompok allotransplantasi dianggap sebagai antigen asing oleh sistem kekebalan tubuh resipien. Ada dua mekanisme pengenalan jaringan asing oleh resipien dalam mekanisme penolakan allotransplan, yaitu pengenalan langsung dan tak langsung (Sayegh dan Turka, 1998). Pada pengenalan langsung, sel T resipien mengenali secara langsung molekul MHC (Major Hystocompatibility Complex), kelompok gen yang bertanggung jawab terhadap reaksi penolakan donor, sedangkan pada pengenalan tak langsung, MHC donor terurai terlebih dahulu, kemudian peptida dari hasil katabolisme MHC donor akan berikatan dengan MHC resipien sehingga dapat dikenali oleh sel T resipien. Sel T pembantu (Th) dalam hal ini yang mengenali antigen secara tak langsung maupun sel T sitotoksik (Tc) yang mengenali antigen secara langsung mampu menghasilkan sitokin yang akan mengaktivasi Tc, sel B, dan makrofag (termasuk neutrofil) untuk menghancurkan dan mengeliminasi (fagositosis) sel atau antigen donor (Sayegh dan Turka, 1998; Baratawidjaja 2000). Reaksi penolakan secara langsung umumnya terjadi pada penolakan akut atau yang telah tersensitisasi (misalnya penolakan pada transplantasi kedua), sedangkan rekasi tak langsung berlangsung lebih lama dan terjadi pada penolakan kronis. Mengingat pada penelitian ini merupakan transplantasi yang pertama serta jaringan mampu bertahan sampai 30 hari setelah transplan, maka kemungkinan besar penolakan melalui mekanisme tak langsung, meskipun tidak tertutup kemungkinan kedua jenis penolakan ini terjadi bersamaan.
Kecenderungan jumlah resipien yang bersiklus dan jumlah ovarium donor yang tumbuh lebih banyak pada kelompok tanpa bursa ovari dibandingkan dengan kelompok dengan bursa ovari kemungkinan disebabkan oleh kontak secara langsung ovarium tanpa bursa mempercepat pembentukan vaskularisasi dari ginjal ke ovarium sehingga mempercepat persembuhan. Karena pengamatan dilakukan setelah hari ke-30 pascatransplantasi, perbedaan di awal masa persembuhan tidak nyata perbedaannya ketika diamati pada akhir pengamatan. Perbedaan juga sulit teramati karena adanya reaksi penolakan oleh sel-sel radang pada kedua kelompok perlakuan.
Jumlah folikel kelompok allotransplantasi jauh lebih sedikit dibanding jumlah folikel pada kelompok kontrol serta jumlah folikel yang dilaporkan oleh peneliti sebelumnya (Liu et al., 2002). Peneliti tersebut menggunakan mencit strain khusus yang tidak memiliki imunitas (imunodefisiensi) sehingga tidak terjadi reaksi penolakan meskipun sama-sama menggunakan teknik allotransplantasi. Hal yang sama pada penelitian ini, kelompok kontrol yang mengalami perlakuan autotransplantasi dari ovarium milik sendiri juga tidak menimbulkan reaksi penolakan. Akibatnya jumlah folikel pada autotransplantasi atau allotransplantasi menggunakan resipien imunodefisiensi lebih banyak dibandingkan dengan allotransplantasi pada penelitian ini yang menggunakan resipien non-imunodefisiensi.

SIMPULAN
Tidak terdapat perbedaan yang nyata pada kelompok allotransplantasi ovarium donor dengan dan tanpa bursa, akan tetapi allotransplantasi menyebabkan penurunan jumlah resipien yang bersiklus, jumlah dan morfologi normal ovarium donor serta jumlah folikel yang berkembang pascatransplantasi dibandingkan dengan kelompok kontrol (autotransplantasi). Reaksi penolakan terjadi pada ovarium allotransplantasi yang ditandai oleh keberadaan sel radang terutama sel limfosit.

DAFTAR PUSTAKA
Baratawidjaja, K.G. 2000. Imunologi Dasar. Edisi ke-4. Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta.
Corleta, H.E., O. Corleta, E. Capp, and M.I. Eldeweiss. 1998. Subcutaneous autologous ovarian transplantation in Wistar rats maintains hormone secretion. Fertil. Steril. 70:16-19.
Cox, S.L., J. Shaw, and G. Jenkin. 1996. Transplantation of cryopreserved fetal ovarian tissue to adult recipients in mice. J. Reprod. Fertil. 107: 315-322.
Fox, R.R. and C.W. Laird. 1970. Sexual Cycles. Di dalam: Hafez ESE (editor) Reproduction and Breeding Techniques for Laboratory Animals. Lea & Febiger. Philadelphia.
Gosden, R.G., M.I. Boulton, K. Grant, and R. Webb. 1994. Follicular development from ovarian xenografts in SCID mice. J. Reprod. Fertil. 101:619-623.
Gunasena, K.T., J.R.T. Lakey, P.M. Villines, M. Bush, C. Raath, E.S. Critser, L.E. McGann, and J.K. Critser. 1998. Antral follicles develop in xenografted cryopreserved african elephant (Loxodonta africana) ovarian tissue. Anim. Reprod. Sci. 53:265-275.
Gunasena, K.T., J.R.T. Lakey, P.M. Villines, E.S. Critser, and J.K. Critser. 1997. Allogeneic dan xenogeneic transplantation of cryopreserved ovarian tissue to athymic mice. Biol. Reprod. 57:226-231.
Hafez, E.S.E. and B. Hafez. 2000. Reproduction in Farm Animals. 7th ed. Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia.
Liu, J., J. Van der Elst, R. Van den Broecke, and M. Dhont. 2002. Early massive follicle loss and apoptosis in heterotropically grafted newborn mouse ovaries. J. Hum. Reprod. 17:605-611.
Liu, J., J. Van der Elst, R. Van den Broecke, Dumortier, and M. Dhont. 2000. Maturation of primordial follicles by combination of grafting and in vitro culture. Biol Reprod 62:1218-1223.
Mohamad, K., K. Budiarta, I.K.M. Adnyane, I. Djuwita, dan A. Boediono. 2003. Siklus estrus dan bobot uterus setelah autotransplantasi ovari secara subkutan pada mencit yang diberi dan tanpa superovulasi. Hayati 10:100-105.
Mohamad, K., I.F. Ramadhan, I. Djuwita, dan A. Boediono. 2004. Perbandingan siklus estrus, bobot uterus, dan periode bunting semu pada mencit yang mengalami autotransplantasi ovarium di subkutan dan subkapsula ginjal. Hayati 11:76-82
Newton, H. 1998. The cryopreservation of ovarian tissue as a strategy for preserving the fertility of cancer patient. Hum. Reprod. Update 4:237-247.
Oktay, K., E. Buyuk, Z. Rosenwaks, and J. Rucinski. 2003. A technique for transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Fertil. Steril. 80:193-198.
Oktay, K., H. Newton, Y. Aubard, O. Salha, and R.G. Gosden. 1998. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril 69:1-7.
Sayegh, M.H. and L.A. Turka. 1998. The role of T-cell costimulatory activation pathway in transplant rejection. N. Engl. J. Med., 338:1813-1821.
Shaw, J.M., A. Oranratnachai, and A.O. Trounson. 2000. Fundamental cryobiology of mammalian oocytes and ovarian tissue. Theriogenology 53:59-72.
Snow, M., S.L. Cox, G. Jenkin, A. Trounson, and J. Shaw. 2002. Generation of life young from xenografted mouse ovaries. Science 297:2227.
Sztein, J., H. Sweet, J. Farley, and L. Mobraaten. 1998. Cryopreservation and orthotopic transplantation of mouse ovaries: New approuch in gamete banking. Biol. Reprod. 58:1071-1074.