Fraksinasi Protein Tegumen Cacing Hati (Fasciola sp)
dan Tanggap Kebalnya pada Mencit

(FRACTIONATION TEGUMENT PROTEIN OF LIVER FLUKE
(FASCIOLA SP.) AND THEIR IMMUNE RESPONSE IN MICE)

IDA AYU PASTI APSARI

Lab Parasitologi Veteriner Fakultas kedokteran Hewan,
Universitas Udayana, Jalan Dr.Goris Denpasar 80232

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengidentifikasi dan mengetahui tanggap kebal fraksi protein tegumen cacing hati pada mencit.
Protein tegumen diisolasi berdasarkan metode Oaks et al. (1981) yang dimodifikasi oleh Wiest et al. (1991) menggunakan tiga macam deterjen yaitu sodium dodecyl sulphate (SDS) , triton X-100, dan cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB).
Protein yang terisolasi difraksinasi dengan sodium dodecyl sulphate polyacrila- mide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
Fraksi protein yang dihasilkan disuntikkan pada mencit untuk melihat tanggap kebalnya. Tanggap kebal yang terbentuk diukur dengan enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).
Hasil penelitian mendapatkan pola fraksi protein yang sama dari ketiga deterjen yang digunakan. Protein tegumen cacing hati terfraksinasi menjadi 13 macam fraksi yang mempunyai berat molekul antara 6,5 kDa sampai 116 kDa. Fraksi protein utama yaitu berat molekul 12,9 kDa (P1), 26,6 kDa (P2), 40,6 kDa (P3) dan 60,9 kDa (P4), disuntikan pada mencit yang kemudian menghasilkan tanggap kebal yang tidak berbeda nyata (P>0,05).

Kata kunci : Tegumen, deterjen, SDS-PAGE, ELISA

ABSTRACT

Fresh Fasciola Sp. collected from infected cattle were provided as a ready source of material for this study. Tegument proteins were isolated base on the method of Oaks et al. (1981) as modified by Wiest et al. (1991) using lysis buffer containing deterjent , such as sodium dodecyl sulphate (SDS), triton X-100 and cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB).
The isolated proteins separated on SDS-polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), showed the same protein pattern. Four major bands P1, P2, P3 and P4 with molecular weight approximately 12.9, 26.6, 40.6 and 60.9 kDa were respectively isolated
From gel, and three mice were injected with each band of tegument proteins.
The immune response of mice injected with each protein measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), showed that the difference of each treatment was statistically non-significant (P>0.05).

Key words : Tegument, deterjent, SDS-PAGE, ELISA

PENDAHULUAN

Pada saat ini, kemajuan dan perkembangan bioteknologi sudah sangat pesat sehingga memungkinkan untuk pembuatan vaksin serta reagen diagnostik terhadap cacing hati. Untuk maksud ini diperlukan cara atau metode isolasi antigen yang sesuai. Identifikasi dan karakterisasi antigen adalah hal yang mutlak guna pengembangan reagen diagnostik tersebut.
Penelitian terhadap antigen dari bahan tegumen beberapa spesies cacing sudah pernah dilakukan (Parkhouse et al., 1981 yang dikutip oleh Anders et al., 1982; Oaks et al., 1981; Freedman et al., 1988). Semua peneliti tersebut menggunakan deterjen untuk melarutkan antigen permukaan cacing . Informasi tentang efek deterjen untuk melarutkan permukaan cacing hati yang dihubungkan dengan sifat antigenesitas antigen permukaannya masih sangat terbatas, untuk itu perlu dilakukan penelitian untuk melihat pengaruh deterjen terhadap cacing hati.
Cacing hati sepanjang tubuhnya ditutupi oleh tegumen. Membran plasma terluar dilapisi oleh glikokaliks. Tegumen dan glikokaliks berperan dalam menimbulkan tanggap kebal dan juga pada interaksi secara fisiologis antara induk semang dan parasit ( Smyth dan Halton 1983 yang dikutip oleh Ikeda dan Oikawa, 1991 ). Cacing hati menghindarkan diri dari tanggap kebal induk semang melalui perubahan antigenesitas tegumen dan glikokaliks.
Deterjen melarutkan komponen lemak dan protein yang terdapat pada membran sel. Tingkat kelarutan membran permukaan dan protein yang terlarut berbeda–beda tergantung dari konsentrasi deterjen, kekuatan ionuk deterjen dan pH dari deterjen yang bersangkutan ( Anders et al., 1982 ). Protein yang larut merupakan antigen terbaik diantara komponen yang menyusun tegumen, karena besarnya ukuran dan kompleksnya struktur melekulnya. Dengan elektroforesis, protein dapat dipisahkan menjadi fraksi–fraksi protein berdasarkan berat melekulnya. Menurut Tizard (1982) dan Goodman (1982), kebanyakann protein yang memiliki sifat antigenik adalah yang berat melekulnya lebih besar dari 10 kDa.

MATERI DAN METODE
Bahan Penelitian
Penelitian ini menggunakan cacing hati yang diperoleh dari Rumah Pemotongan Hewan dengan tiga deterjen yaitu sodium dodecyl sulphate (SDS), triton X-100, cetyl trimetyl ammonium bromide (CTAB) sebagai bahan untuk isolasi protein. Gel akrilamid sebagai bahan untuk fraksinasi protein serta hewan percobaan mencit digunakan untuk melihat tanggap kebalnya yang akan dideteksi dengan ELISA menggunakan antimouse IgG alkaline phosphatase conjugate.

Analisis Protein
Analisis protein tegumen secara kuantitatif menggunakan metode Oaks et al. (1981) yang dimodifikasi oleh Wiest et al. (1991) yaitu cacing hati segar yang diambil dari saluran empedu sapi, dicuci dengan phosphate buffer saline (PBS) steril sampai bersih. Setiap perlakuan menggunakan sepuluh cacing hati yang dimasukkan ke dalam tabung plastik. Tabung dikocok menggunakan vorteks dengan kecepatan maksimal selama 30 menit dan setiap lima menit ditambahkan 1 mM PMSF. Untuk perlakuan dengan deterjen (SDS, triton X-100, CTAB) masing-masing ditambahkan 1 ml.. Hasil ekstraksi ini dipusing dengan kecepatan 15.000 g selama 15 menit pada 4°C. Supernatan hasil pemusingan diambil untuk dilakukan lyofilisasi menggunakan freeze-dryer . Hasil freeze-dryer ini berupa serbuk kering protein tegumen yang selanjutnya ditentukan konsentrasinya menggunakan Bio-rad protein microassay (Bradford, 1978).
Analisis protein secara kualitatif dengan metode Laemmli (1970) menggunakan SDS-Page untuk menentukan fraksi protein yang terbentuk . Fraksi protein yang terbentuk dari hasil elektroforesis, kemudian ditentukan berat molekulnya melalui perhitungan mobilitas relatif yang kemudian diestimasikan pada kurva kalibrasi karakteristik protein standar.

Isolasi Protein dari PAGE
Isolasi protein dari polyacrila- mide gel electrophoresis (PAGE) menurut metode Miller et al., (1989) yaitu fraksi-fraksi protein yang terdapat pada PAGE dipilih empat jenis yang mempunyai berat molekul di atas 10 kDa (P1, P2, P3, dan P4). Masing-masing fraksi protein yang terpilih ini dipotong, dicuci tiga kali dengan PBS steril pH 7,4, dihancurkan dengan mortal, dan dilarutkan dengan PBS steril. Isolasi protein dari PAGE bertujuan untuk memperoleh protein sebagai antigen yang akan diinjeksikan pada mencit.
Protein antigen P1, P2, P3, dan P4 diemulsikan dengan Freud adjuvant complete 1:1. Kemudian setiap protein antigen diinjeksikan pada tiga ekor mencit dengan dosis 0,2 ml (2 mg/ml) tiap ekor mencit secara intraperitoneal. Injeksi diulang setiap dua minggu sekali dengan dosis yang sama. Pada injeksi yang ketiga diemulsikan dengan Freud adjuvant complete. Setelah delapan minggu dilakukan pengambilan darah mencit untuk mengetahui tanggap kebalnya.

Analisis Data
Data yang diperoleh berupa konsentrasi protein hasil isolasi tegumen cacing hati, banyaknya fraksi protein dan berat molekul protein tegumen hasil elektroforesis, dan imunogenesitas protein yaitu tanggap kebal yang terbentuk pada mencit, dianalisis secara deskriptif dan analisis Varian (Gill, 1978).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Analisis protein tegumen secara kuantitatif didapatkan hasil seperti Tabel 1. Rata-rata konsentrasi protein tegumen diisolasi tanpa deterjen, dengan SDS, triton X-100 dan CTAB berturut-turut adalah 71,81 ± 7,22 mg/mg, 66,04 ± 24,61 mg/mg, 69,18 ± 14,45 mg/mg, dan 127,78 ± 9,03 mg/mg dalam ekstrak kering. Hasil analisis varian menunjukkan perlakuan dengan deterjen pada protein tegumen menghasilkan konsentrasi protein yang berbeda sangat nyata (P Analisis protein secara kualitatif dengan 15% SDS-PAGE terhadap protein yang terisolasi, baik tanpa deterjen maupun dengan deterjen hasilnya adalah sama, yaitu diperoleh gambaran 13 macam fraksi protein yang terpisah. Identifikasi fraksi-fraksi protein ini berdasarkan berat molekulnya diperoleh kisaran antara 6,5 kDa sampai 116 kDa.
Antigen yang diinjeksikan ke mencit dipilih pita-pita (band) protein utama yaitu P1,P2, P3, dan P4. Setelah dilakukan perhitungan mobilitas relatif (Rf) dan diestimasikan ke kurva kalibrasi karakteristik protein standar menurut rumus Weber dan Osborn (1969) yang disitir oleh Supardi (1983), diperoleh berat molekul berturut-turut 12,897 kDa, 26,615 kDa, 40,613 kDa, dan 61,973 kDa.
Fraksi-fraksi protein utama ini dipilih sebagai antigen yang diinjeksikan ke mencit dan ternyata dapat menimbulkan tanggap kebal dengan terbentuknya antibodi yang dapat dideteksi pada uji ELISA (Tabel 2).

Tabel 1. Konsentrasi Protein Tegumen Cacing Hati Hasil Isolasi
dengan Deterjen yang Berbeda

Perlakuan Ulangan Konsentrasi protein (ug/mg) Rata-rata
Tanpa deterjen 1 23 70,23679,68465,512 71,82 a7,22 (SD)
Deterjen SDS 123 32,23679,90090,708 66,04 a 24,61 (SD)
Deterjen triton X-100 123 49,76484,408 3,384 69,18 a 14,45 (SD)
Deterjen CTAB 123 126,928 139,528 117,480 127,96 b 9,03 (SD)
Keterangan : huruf yang sama kearah kolom menunjukkan tidak berbeda
nyata (P>0,05). SD = Standar Deviasi

Tabel 2. Hasil Uji ELISA (OD) terhadap Protein (Antigen) Terpilih
Pengenceran No Kontrol P1 P2 P3 P4
10-1 123 0,2910,2620,251 1,1290,7130,837 0,8430,7970,798 0,8510,8100,996 0,9940,9231,185
10-2 123 0,2520,2490,238 0,9660,7070,682 0,7280,7260,792 0,8500,7400,987 0,8230,8901,233
10-3 123 0,2090,2180,197 0,8680,4060,425 0,5580,3360,635 0,4820,6780,548 0,4660,7961,018
10-4 123 0,1890,1800,183 0,7420,2840,289 0,2920,2520,287 0,3140,5490,449 0,2920,6030,690

Tabel 2 menunjukkan tanggap kebal mencit terhadap P1, P2., P3 dan P4 yang jelas berbeda jika dibandingkan dengan kontrol, namun secara statistik ternyata tidak berbeda nyata (P>0,05). Dari hasil ini dapat disimpulkan bahwa antigen yang berasal dari protein tegumen cacing hati dengan berat molekul lebih dari 10 kDa, ternyata membentuk tanggap kebal yang berbeda tidak nyata (P>0,05).

KESIMPULAN
Protein tegumen cacing hati terpisah menjadi 13 macam fraksi protein yang mempunyai berat molekul antara 6,5 kDa sampai 116 kDa. Berdasarkan nilai OD fraksi protein dengan berat molekul berbeda membentuk tanggap kebal yang secara statistika tidak berbeda nyata.

DAFTAR PUSTAKA
Anders, R.F., R.J. Howard, and G.F. Mitchell. 1982. Parasite Antigens and Me
thods of Analysis In : Immunology of Parasitic infection by Sydney Cohe
and Kenneth S.W. Second Ed. Blackwell Scientific Pub. Oxford-London :
73-83.
Bradford, C.E. 1978. A Rapid and Sensitive Method for Qualitation of Microgram
Quantitaties of Protein Utilizing the Principle of Binding.Anal.Biochem.72-
248.
Freedman, D.O., T.B. Nutman, and E.A. Ottesen. 1988. Enhached Solubilization
of Immunoreactive Protein from Brugia malayi Adult Parasite Using Cetyl-
trimethyl Ammonium Bromide. Exp.Par. 65, 241-244.
Georgi, J.R., and M.E. Georgi. 1990. Parasitology for Veterinarians. 5th Ed. W.B.
Sounders Company.
Gill, J.L. 1978. Design and Analysis of Experimental in the Animal and Medical
Science. 1st Ed. Iowa State University, Press Ames, Iowa, USA.
Goodman, J.W. 1982. Immunogenicity and Antigenic Specificity In : Basic and
Clinical Immunology. Ed.B. Stites, D.P. and A.I. Terr, Lange Medical Book.
7th Ed. 101-108
Hanna, R.E.B. 1980. Fasciola hepatica Glycocalyx Replacement in Juvenile as
Possible Mechanism for Protection Against Host Immunity. Exp.Parasitol.
50-103.
Ikeda, T., and Y. Oikawa. 1991. Paragonimus ohirai : Immunobiochemical
Characterization the Tegumental Glycocalyx of Excysted Juvenile
Recognized by a Monoclonal Antibodies. Exp.Parasitol. 72, 252-261.
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of Stuctural Protein During Assembly of the Head of
Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.
Miller, S., D.M. Rekosh, and P.T. Levende. 1989. Schistosoma mansoni :Identifi
cation and Characterization Schistomula Polypeptides. Exp.Parasitol. 69, 244-
262.
Oaks, J.M., G.D. Cain, D.A. Mower, and R.K. Raj. 1981. Disruption and Removal
of the Tegumen from Schistosoma mansoni with Triton X-100. J.Parasitol. 67
(6)761-775.
Supardi, W. 1983. Isolasi dan Karakterisasi Suatu Protease Sulfhidril dan Sperma
tozoa Sapi Fresien Holstein. Disertasi Doktor, ITB, Bandung.
Tizard, I.A.N. 1982. Pengantar Imunologi Veteriner. Edisi Kedua. UI.Press. Jakarta. Wiest, P.W., G.R. Old, and W.D. Bowen. 1991. Shistosoma mansoni : Protein
Phosphorilation During Transformation of Cercariae to Schistomula.
Exp.Parasitol. 73, 214-222.