Karakterisasi Protein Avian Reovirus 1091
dengan Uji Radioimunopresipitasi Menggunakan
Antibodi Poliklonal dan Monoklonal

(CHARACTERIZATION OF THE PROTEINS OF AVIAN REOVIRUS 1091
BY RADIOIMMUNOPRECIPITATION USING POLYCLONAL AND MONOCLONAL ANTIBODIES)

I NYOMAN MANTIK ASTAWA
Laboratorium Virologi Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Udayana Denpasar 80232

ABSTRAK

Karakterisasi protein avian reovirus 1091 dilakukan dengan uji radioimunopresipitasi menggunakan antibodi poliklonal dan monoklonal. Protein dilabel dengan 35-S, dipresipitasi dengan antibodi poliklonal dan monoklonal. Protein terpresipitasi kemudian diisolasi dengan sepharose 4B yang dikonjugasikan dengan protein A. Protein khas virus kemudian dianalisis dengan SDS-PAGE dan divisualisasikan dengan film sinar X. Setidak-tidaknya 10 protein khas avian reovirus galur 1091 dapat dipresipitasikan dengan antibodi poliklonal dan monoklonal. Protein tersebut adalah: lA (135Kda), lB (120 Kda), lC (105Kda), mA (76KDa), mB/mBC (73/71 KDa), sA (46 Kda) sB(43Kda), sNS (41Kda), dan s3 (38 Kda). Empat protein (lB mB/mBC dan sB) tampaknya terpapar ke permukaan virion.
Studi ini dapat dipakai sebagai dasar dalam penelitian tentang fungsi masing-masing protein dalam proses terjadinya penyakit.

Kata kunci: avian reovirus;

ABSTRACT
The proteins of avian reovirus 1091 was identified by radioimmunoprecipitation using polyclonal and monoclonal antibodies against the virus.Viral proteins were labeled with 35-S and precipitated with polyclonal and monoclonal antibodies. The precipitated proteins were isolated by sepharose 4B-Protein A bead and analysed by sodium dodecyl sulphate- gel electrophoresis (SDS-PAGE). The protein bands were virualysed by exposing the dried gel onto Fuji X-film.
At least 10 viral-spesific proteins designated as lA (135Kda), lB (120 Kda), lC (105Kda), mA (76KDa), mB/mBC (73/71 KDa), sA (46 Kda) sB(43Kda), sNS (41Kda), dan s3 (38 Kda) were identified. One protein designated as, mNS was not identified in this study. Four proteins (lB, mB/mBC sB) were exposed on the surface of the virion.
This studies provides a basis for further characterization of the role of each proteins in the disease process.

Key word :..

PENDAHULUAN
Avian Reovirus adalah sekelompok virus yang secara patogenik sangat heterogen. Pada ayam, virus ini telah diketahui sebagai penyebab tenosinovitis (arthritis menular) (Kibenge et al., 1982, Olson, 1978), enteritis dan runting/stunting syndromme (Robertson and Wilcox, 1986), perikarditis dan kelainan pada jantung (Goodwin et al., 1993). Selain menyerang ayam, virus ini juga dapat menyerang berbagai jenis unggas lain seperti kalkun menyebabkan enteritis (Page et al., 1982)), anak burung dara menyebabkan perikarditis dengan angka kematian sekitar 5% (Tanyi et al., 1994a dan b), dan burung puyuh muda menyebabkan kematian (Magee et al., 1993).
Selain dari segi patogenitas, avian reovirus avian juga sangat heterogen dari segi antigenik (Meanger, 1990). Heterogenitas antigenik semacam ini sangat menyulitkan dalam merancang metode diagnosis serta dalam penerapan program vaksinasi yang tepat. Identifikasi protein khas avian reovirus 1091 merupakan langkah awal dalam penentuan protein secara antigenik khas kelompok maupun khas untuk galur tertentu. Pengetahuan semacam ini sangat bermanfaat baik dalam diagnosis maupun dalam vaksinasi. Selain itu identifikasi protein juga berperan dalam mempelajari struktur dan komposisi virus yang pada gilirannya dapat menjadi dasar dalam menentukan protein virus yang berperan dalam proses terjadinya penyakit.
Karakterisasi protein avian reovirus telah dilakukan pada beberapa galur seperti galur S1133 (Schnitzer et al., 1982; Varela dan Benavente, 1994) dan galur RAM-1 (Wickramasinghe et al., 1993). Reovirus avian galur 1091 diisolasi dari ayam penderita runting/stunting syndromme (Pass et al., 1982), dan secara antigenik galur ini sangat berbeda dari galur reovirus avian lainnya seperti galur RAM-1 yang diisolasi dari ayam normal, dan galur S1133 penyebab tenosynovitis pada ayam (Schnitzer et al., 1982). Oleh karena itu karakterisasi protein virus ini diharapkan dapat menjadi landasan dalam mengungkap perbedaan patogenitas dan antigenik galur reovirus ini dengan kedua galur sebelumnya atau dengan galur reovirus yang lain..
Identifikasi protein khas virus dapat dilakukan dengan uji serologis. Salah satunya adalah uji radioimunopresipitasi. Dalam makalah ini dibahas mengenai identifikasi protein avian reovirus galur 1091 dengan uji imunopresipitasi menggunakan antibodi monoklonal dan poliklonal.

MATERI DAN METODE
Virus
Avian reovirus galur 1091 diisolasi dari ayam kerdil penderita runting/stunting syndromme (Pass et al., 1982) dan virus ini telah diadaptasikan untuk tumbuh pada biakan sel Vero suatu biakan sel lestari asal ginjal monyet hijau Afrika.

Penyiapan antibodi monoklonal dan poliklonal
Antibodi monoklonal (AbMo) dibuat dengan cara fusi sel myeloma dengan sel limfosit asal mencit yang telah dikebalkan terhadap avian reovirus galur 1091. Sel hasil fusi (hibridoma) mula-mula dibiakkan dalam media penumbuh selektif DMEM-HAT (hypoxanthine aminopterin dan thymidine) dan dilanjutkan dengan media DMEM-HT (DMEM-HAT tanpa aminopterin (Astawa, 1995). AbMo dihasilkan dengan mengisolasi sel hibridoma penghasil antibodi khas reovirus avian galur 1091 dan menumbuhkannya dalam media DMEM-HT sampai sel mencapai ambang titik kematian. Selain itu, AbMo juga dihasilkan dengan menyuntikkan sel hibridoma penghasil AbMo ke dalam ruang peritoneum mencit dua minggu sebelumnya telah disuntik dengan pristane (Astawa, 1995).
Serum poliklonal disiapkan dengaan cara menginfeksi ayam umur 12 minggu melalui jalur intranasal dan intrakonjungtiva. Serum ayam diambil tiga minggu setelah infeksi. Serum diinaktifkan pada suhu 56oC selama 30 menit dan disimpan dalam aliqout kecil pada suhu -20oC sampai digunakan .

Pelabelan protein reovirus avian galur 1091 dengan isotop radioaktif
Protein reovirus avian 1091 dilabel dengan isotop 35-S. Biakan sel Vero yang ditumbuhkan dalam cawan petri berdiameter 60 mm diinfeksi dengan avian reovirus galur 1091 dengan multiplisitas infeksi sebesar lima. Setelah adsorpsi selama duajam pada suhu 37 oC, inokulum dibuang dan diganti dengan media DMEM 5%FCS. Sel diinkubasi selama sembilan jam, medianya dibuang dan sel dicuci tiga kali dengan PBS steril. Sel terinfeksi kemudian dipelihara dengan medium DMEM tanpa metionin, dilengkapi dengan 10 uCi 35-S metionin (ICN-USA) per ml FCS 5% yang telah didialisis. Sel kemudian diinkubasikan kembali selama dua jam pada suhu 37 oC . Setelah medianya dibuang, sel dicuci tiga kali dengan PBS dingin , dan dilisiskan dengan menambahkan 1 ml larutan pelisis sel (10mM Tris-HCl, 0,5% Nonidet 150 nM NaCl, 1mM phenylsulfonylflouride pH. 7,5). Sel dimasukkan ke dalam es selama 30 menit, lisatnya dipindahkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml, dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 g selama 15 menit. Supernatan ditampung dan kembali disentrifugasi dengan kecepatan 145.000 g selama 60 menit. Cairan supernatan ditampung dan dipakai untuk uji radioimunopresipitasi.

Imunopresipitasi protein khas virus dengan antibodi poliklonal dan monoklonal
Tabung eppendorf 1,5 ml yang berisi 200 ml lisat sel terinfeksi avian reovirus 1091 terlabel dengan 35-S, ditambahkan 200 ml cairan supernatan biakan sel hibridoma atau 10 ml cairan ascites mencit yang mengandung AbMo atau 10 ml serum ayam yang mengandung antibodi poliklonal (AbPo) anti avian reovirus 1091. Volume cairan masing-masing tabung eppendorf disesuaikan menjadi 500 ml dengan penambahan larutan pelisis sel, campuran tersebut diinkubasikan selama satu malam pada suhu 4 oC . Jika yang ditambahkan adalah serum ayam anti- avian reovirus 1091, maka 5 jam setelah inkubasi, ditambahkan 20 ml serum kelinci anti IgG ayam (Nordic) dan langkah selanjutnya sama dengan AbMo. Protein khas virus yang berikatan dengan antibodi kemudian diisolasi dengan menambahkan 100 ml Protein A-sepharose 4B (Pharmacia) 8,5%. Setelah inkubasi selama 30 menit pada suhu 4 oC dengan pengadukan secara terus menerus, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12000 g selama 1 menit. Cairan supernatan dibuang dan diganti dengan 1,5 ml larutan pelisis sel yang mengandung SDS 1%. Campuran diaduk dan disentrifugasi kembali seperti di atas. Langkah pencucian ini diulang sebanyak tiga kali. Ke dalam masing-masing tabung kemudian dimasukkan sample reducing buffer (SDS 2,3 %, mercaptoethanol 5%, Tris-HCl 0,0625 M. pH. 6,0, gliserol 10%, bromophenol blue 0,001%).

Elektroforesis dan visualisasi protein khas reovirus 1091
Setelah dipanaskan pada suhu 100 oC selama lima menit, protein khas virus yang diisolasi dianalisis dengan sodium dodecylsulphate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Analisis dilakukan dalam gel pemisah 10% pada suhu 4oC selama 17 jam dengan arus listrik 11 mA.. Sebagai penanda berat molekul dipakai protein standar yang dilabel dengan 14-C. Gel selanjutnya difiksasi dengan asam asetat 7% dan dimasukan ke dalam larutan penguat radioaktif R-Amplify (Amersham) masing-masing selama 30 menit. Setelah dikeringkan dengan pengering gel model 1125B (Bio-Rad), gel dipaparkan ke film Fuji-X (Fuji) selama 48 jam pada suhu –70 oC. Film dicuci dengan mesin pencuci film otomatis.

Penentuan berat molekul protein
Berat melekul protein ditentukan dengan mengukur rentang migrasi masing-masing protein yang berat melekulnya telah diketahui. Rentang migrasi masing-masing protein khas virus juga diukur dengan cara yang sama. Rentang migrasi protein digambar pada kertas grafik logaritma dan berat molekul protein khas virus diektrapolasikan dari rentang migrasi protein standar.

Penentuan protein permukaan
Penentuan protein permukaan dilakukan dengan teknik imunoelektromikroskopi menggunakan AbMo terhadap masing-masing protein. Avian reovirus 1091 sediaan setengah murni disentrifugasi dengan kecepatan 1000 g selam 30 menit. Cairan supernatan diambil dan dsentrifugasi kembali pada kekuatan 80.000 g selama 90 menit. Endapan virus diambil dan disonikasi selama satu menit (sonikator sistem panas, model XL2015) dengan sumber energi 100 watt. Suspensi virus yang telah disonikasi disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 g selama 15 menit untuk menghilangkan virus yang teragregasi.
Suspensi virus sebanyak 25 ml dicampur dengan 25 ml cairan ascites mencit yang mengandung AbMo terhadap masing-masing protein (pengenceran 1:100 dalam PBS). Setelah inkubasi selama satu malam pada suhu 4oC, campuran virus-AbMo ditempatkan pada grid berlapis formvar, diwarnai dengan asam fosfotungstik 3% , dan diperiksa di bawah mikroskop elektron.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Protein khas avian reovirus 1091 sebanyak 10 jenis teridentifikasikan dari lisat sel terinfeksi. Berdasarkan posisinya pada gel, kesepuluh jenis protein tersebut dikelompokkan menjadi tiga kelompok . Posisi paling atas (berat molekul paling besar) terdiri dari tiga jenis protein. Posisi di tengah terdiri dari tiga jenis protein dan posisi paling bawah terdiri dari empat jenis protein (Gambar 1A, 1B dan 1C). Setelah diukur, tiga protein pertama berturut-turut mempunyai berat molekul 135, 120 dan 105 Kda. Tiga jenis protein kedua berturut-turut mempunyai berat molekul 76, 73, dan 71 KDa. Sedangkan empat jenis protein terakhir berturut-turut memiliki berat molekul berturut-turut 46, 43, 41, dan 38 KDa (Gambar 1A, 1B dan 1C, Tabel 2).
Reovirus mamalia, kelompok pertama sebagai protein lambda (l) dan kelompok kedua sebagai protein miu (m) dan kelompok protein terakhir sebagai protein sigma (s) (Schiff dan Field, 1991). Masing-masing protein individu diindentifikasi dengan penambahan angka sehingga penyebutannya menjadi l1, l2 , l3, m1/m1C, mNS, s1, s1S, s2, sNS, dan s3. Protein m1C telah dibuktikan sebagai hasil penyibakkan (cleavage) dari protein m1 dan proses penyibakan ini diduga terjadi pada saat perakitan protein menjadi partikel virus. Protein dengan mNS dan sNS adalah protein non-struktural. Sedangkan protein sS diduga merupakan hasil translasi dari open reading frame (ORF) ke-2 dari gen S1 (ORF pertama menyandi protein s1) (Schiff dan Field, 1990, Nibert et al., 1991, Dryden et al., 1994). Dengan demikian maka terdapat setidak-tidaknya 12 protein pada reovirus mamalia.

Tabel 1. Perbandingan protein berbagai galur avian reovirus

Galur 1091 Galur RAM-1 (Wickramasinghe et al., 1993) Galur S-1133 (Varela dan Benavente, 1994)
Protein BM (Kda) Lokasi Protein BM (Kda) Lokasi Segmen Gen Protein
lA 135 ? lA 145 Permukaan L1 l1
lB 120 Permukaan lB 124 Permukaan L2 l2
lC 105 ? lC 105 Permukaan L3 l3
mA 76 ? mNS 76 M1 m1
mB/mBC 73/71 Permukaan mA/mAC 74/72 Permukaan M2 m2/m2C
- mB 68 M3 mNS
sA 46 ? sA 45 S2 s1
sB 43 Permukaan sB 42 Permukaan S3 s2
sNS 41 ? sNS 40 S4 sNS
sC 38 Permukaan sC 37 Permukaan S1 s3

Penyebutan protein individu pada avian reovirus masih sedikit rancu. Sebagian peneliti menggunakan penanda huruf (Schitnzer et al., 1982, Wickramasinghe et al., 1993) dan sebagian lagi menggunakan penanda angka (Varela dan Benavente, 1994). Schnitzer et al. (1982) berhasil mengidentifikasi 9 jenis protein pada reovirus avian galur S1133 yang disebut sebagai protein lA, lB, lC, mA, mB, sNS sA, sB, dan s3 dengan berat molekul berturut-turut 145, 130, 115, 76, 72, 70, 39, 36, 34, dan 32 Kda. Sementara itu, Varela dan Benavente (1994) menemukan 11 protein khas virus pada reovirus avian galur 1133 yaitu l1, l2, l3, m1, m2/m2C, mNS, s1, s2, sNS, dan s3. Temuan peneliti ini tampaknya lebih akurat karena metode yang dipakai adalah metode translasi in vitro sehingga paling tepat dipakai sebagai acuan untuk protein reovirus 1901.
Tabel 2. Ringkasan protein yang diidentifikasi oleh antibodi poliklonal dan
monoklonal

AbPo AbMo
Protein BM (Kda) 4D3 5D10 1E9 4E2 4G6 3F6 5F5 1F3 2G9 5D12
lA 135
lB 120 —– —–
lC 105
mA 76
mB/mBC 73/71 —- —— —— ——-
-
sA 46
sB 43 —- —— ——
sNS 41 ——
sC 38 —— ——- —–
—- Protein yang bereaksi

Jika mengacu pada klasifikasi dan penamaan protein khas avian reovirus menurut Varela dan Benavente (1994) (kecuali penanda angka diganti dengan huruf), maka penyebutan 10 jenis protein pada avian reovirus galur 1091 adalah lA (135Kda), lB (120 Kda), lC (105Kda), mA (76KDa), mB/mBC (73/71 KDa), sA (46 Kda) sB(43Kda), sNS (41Kda), dan s3 (38 Kda). Penambahan huruf dalam penyebutan ini dimaksudkan untuk membedakannya dari reovirus mamalia. Oleh karena itu satu jenis protein yang tidak teridentifikasi dalam penelitian ini adalah protein mNS yang pada reovirus galur S1133 mempunyai berat molekul paling kecil di antara protein m (Varela dan Benavente, 1994). Hasil ini sedikit berbeda dengan penyebutan protein reovirus galur RAM-1 menurut Wickramasinghe et al., (1993) yang mengidentifikasi 11 jenis protein yaitu lA (135Kda), lB (124 Kda), lC (105Kda), mNS (76 Kda), mB/mBC (74/72 KDa), sA (45 Kda) sB(42Kda), sNS (41Kda), dan s3 (39 Kda). Protein dengan BM 76 Kda pada reovirus avian RAM-1 tampaknya paling tepat disebut sebagai protein mA yang disandi oleh gen M1 bukan protein mNS. Selanjutnya perbandingan protein reovirus galur S-1133, RAM-1 dan 1091 dapat dilihat pada Tabel 1.
Perbedaan berat molekul masing-masing protein antara reovirus galur 1091 dan RAM-1 mungkin merupakan indikasi heterogenitas avian reovirus dari segi genetik, antigenik dan patogenitas. Keragaman antigenik dan genetik kedua virus ini pernah di kaji oleh Meanger (1989).
Antibodi monoklonal khas reovirus 1091 dapat mengidentifikasi protein lB(120 Kda), mB/mBC (73/71Kda), sA (46 Kda) sB(43Kda), dan s3 (38 Kda) seperti yang disajikan pada Gambar 1A, 1B dan 1C; Tabel 2. Penggunaan AbMo, selain mempertegas kekhasan protein tersebut juga dapat mengungkap sifat khusus dari protein tertentu. Kekhasan tersebut telah dibuktikan dengan uji FAT dan dan ELISA. Semua AbMo yang dipakai hanya bereaksi dengan sel terinfeksi avian reovirus 1091 dan tidak bereaksi terhadap sel terinfeksi (Astawa, 1995).
Beberapa sifat khas protein tertentu seperti AbMo 4E2, 4G6, dan 4D1 dapat mengenali tiga jenis protein (Gambar 1C) yaitu mB /mBC (73/71Kda) dan sB(43Kda). Reaksi ini menunjukkan bahwa protein mB adalah prekursor dari protein mBC. Jika hal ini sama dengan yang terjadi pada reovirus mamalia, maka penyibakan (cleavage) protein mB menjadi mBC diperlukan sebagai penyesuaian molekul pada saat perakitan virus. Protein mBC ini kemudian berikatan secara kuat dengan protein sB untuk menyusun kapsid bagian luar dari reovirus 1091. Bukti lain yang menunjukkan bahwa protein mBC dan sB merupakan protein permukaan adalah bahwa AbMo (4E2 dan 4D1) yang bereaksi terhadap protein tersebut mampu mengagregasikan partikel virus (Gambar 2).
Selain AbMo terhadap kedua protein tersebut, AbMo terhadap protein sC (5C6) dan AbMo terhadap protein lB (1F3) juga mampu mengagregasikan partikel virus. Sedangkan AbMo terhadap protein lainnya tidak mampu mengagregasikan partikel virus. Ini berarti bahwa protein sC dan lB juga merupakan protein permukaan.. Dengan demikian ada empat protein merupakan protein permukaan yaitu .protein lB, mBC, sB dan, sC. Protein permukaan ini tampaknya berperan penting dalam proses infeksi . Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dari peran masing-masing protein dalam keragaman antigenik dan patogenitas avian reovirus yang ditemukan di lapangan.

A B C

Gambar 1 A dan B. Protein khas avian reovirus 1091 yang diidentifikasi dengan uji radioimunoprsiptasi. Protein dilabel dengan 35-S dan dipresipitasi dan dianalisis seperti yang dijelaskan dalam materi dan metode.

A:. (No.1-5) lisat sel terinfeksi yang berturut-turut dipresipitasi dengan AbMo 5F6, 5F5, AbPo, AbMo, 1F3 dan 2G9.(no, 6 penanda berat molekul)

B (no 1-6) lisat sel terinfeksi yang berturut-turut dipresipitasi dengan AbMo, 4D3, 3F6, 1E9, 5D10, AbPo, 5D12 ( no.7 penanda berat molekul)

C. (no 3-7) lisat sel terifeksi yang berturut-turrut dipresipitasi dengan AbMo 5F5, 4E2, 4D1, 4G6 dsan AbPo. (no 1. Penanda berat molekul). (no.2 lisat sel tidak terinfeksi dipresipitasi dengan AbPo)

AbMo = antibodi monoklonal
AbPo : antibodi poliklonal

Gambar 2. Aggregasi Partikel Virus oleh Antibodi Monoklonal
AbMo 1F3 (A), 4D1 (B), 5D10 (C), 5D12 (D)
Aggregasi partikel virus terlihat pada A, B, C, dan tidak pada D

KESIMPULAN
1. Sepuluh jenis protein khas avian reovirus 1091 diidentifikasi dengan uji radioimunopresipitasi menggunakan antibodi poliklonal dan monoklonal.
2. Empat jenis protein berturut-turut disebut sebagai protein lB, mBC, sB, dan sC pada permukan reovirion galur 1091

DAFTAR PUSTAKA
Astawa, N.M, 1995. Studies of the biological function of avian reovirus proteins.
Ph.D thesis. Murdoch University Australia.
Dryden, K.A., M.Yeanger, L.Nibert, et al., K.M. Combs, D.B. Furlong, B.N.
Field, and T.S. Baker. 1994. Early steps in reovirus infection are associated with dramatic changes in supramolecular structure and protein conformation: Analysis of virion and subviral structure by cryoelectron microscopy and image reoconstruction. Journal of cell Biology 122:1023-1041

Goodwin, M.A., J.F. Davis, and E.C. Payer. 1993. Reovirus associated with
enteritis in georgia broiler chicks. Avian Diseases 37: 229 – 233.
Kibenge, F.S.B, M.D. Robertson, G.E. Wilcox, and D.A. Pass. 1982. Bacterial and
viral agent associated with tenosynovitis in broiler broader in Western Australia. Avian Pathology, 11:351-359.
Magee, D.L., R.D. Montgomery, W.R. Martin, C.C.Wu, and S.W. Jack. 1993..
Reovirus associated with excessive mortality in young Bowhite quil. Avian
diseases: 37: 1130 – 1135.
Meanger, J. 1989. Antigenik and immunogenic characteristics of avian reovirus,
Ph.D. thesis Murdoch University, Australia.
Nibert, M.L., D.B. Furlong, and B.N. Field. 1991. Mechanism of Viral
Pathogenesis:distinct form of reovirus and their role during replication in cells
and host. Journal of Clinical investigation 88: 724-734.
Olson, N.O. 1978. Reovirus infection in “Disease of poultry”(Hofstad et al, Eds). 7th.
Edition. Iowa state University Press. Pp. 641: 647.
Page , R.K., O.J. Fletcher, and P.Villegas. 1982. Infectious tenosynovitis in young
turkey. Avian diseases 26: 924- 927.
Pass, D.A., M.D. Robertson, and G.E. Wilcox. 1982. Runting/stunting syndromme
in broiler chickens in Australia. Veterinary record 110: 386-387.
Robertson, M.D. dan G.E. Wilcox. 1986. Avian reoviruses. Veterinary Bulletin 56:
155- 565.
Schiff, L.A. and B.N. Field. 1990. Reoviruses and their replication. In “Field
Virology “ (Bernard N. Field and Devid M. Kinipe, eds). Raven Press. New
York pp. 1275 – 1306.
Schnitzer, T.J., T.Ramos, and V. Govea. 1982. Avian reovirus polypeptida analysis
of intracellular virus specified products, virions, top component, and cores.
Journal of Virology. 43: 1006-1014.
Tanyi , J., R. Glavitis, G. Salyi, P. Rudas, and E. Kosa, and J. Szabo. 1994a.
Pancreatitis caused by reovirus in guinia poult..Magyar Allatorvosok Lapya 49
:163 – 170.
Tanyi , J., R.Glavitis, G. Salyi, P.Rudas, E. Kosa, and J. Szabo. 1994b.
Pancreatitis caused by reovirus in guinia fowl 2. Avian Pathology 23: 61 – 70.
Varela dan Benavente. 1994. Protein Coding assignment of avian reovirus strain
S1133. Journal of virology 68: 6775 –6777
Wickramasinghe, R., J. Meanger, C.E. Enriquez, C.E. and G.E. Wilcox. 1993.
Avian reovirus protein associated with netralization of viral infectivity. Virology 1994: 332 – 339.