AKTIVITAS NETRALISASI ANTIBODI MONOKLONAL TERHADAP AVIAN REOVIRUS 1091 PADA BIAKAN SEL PRIMER GINJAL ANAK AYAM
I NYOMAN MANTIK ASTAWA
Laboratorium Virologi Veteriner
Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana

Abstrak

A
ktivitas netralisasi antibodi monoklonal (AbMo) terhadap avian reovirus 1091 pada biakan sel primer ginjal anak ayam diuji dengan uji netralisasi penurunan jumlah plak (plaque reduction neutralization test/PRNT). AbMo-anti avian reovirus 1091 dibuat dengan cara fusi limfosit asal limpa mencit Balb/c yang kebal terhadap avian reovirus 1091, dengan limfosit imortal (myeloma) asal mencit. Fusi kedua jenis sel tersebut menghasilkan sel hibrida (hibridoma) yang mengeluarkan antibodi spesifik terhadap satu epitop dalam satu jenis protein dan antibodi yang dikenal dengan sebutan antibodi monoklonal (AbMo). Protein virus yang bereaksi dengan masing-masing AbMo ditentukan dengan menggunakan uji radioimmunoprecipitation (RIP) dan Western immunoblotting. Aktivitas netralisasi AbMo anti-avian reovirus 1091 ditentukan dengan PRNT terhadap avian reovirus 1091 pada primer ginjal anak ayam.
Uji PRNT menunjukkan bahwa AbMo 5A6 (terhadap protein mB/mBC) dan AbMo 5A12, 5B11 dan 5C6 (ketiganya terhadap protein sC) mampu menetralisasi avian reovirus 1091 pada biakan sel primer asal ginjal anak ayam. Hal ini menunjukkan bahwa protein mB/mBC dan sC berperan dalam proses infeksi avian reovirus yaitu masuknya virus ke dalam sel ginjal anak ayam karenany berpotensi sebagai bahan vaksin yang imunogenik dan protektif.

Kata kunci : antibodi, monoklonal, avian reovirus

NEUTRALIZING ACTIVITITIES OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST AVIAN REOVIRUS 1091 IN CHICKEN KIDNEY PRIMARY CELL CULTURE

Abstract
Neutralizing activities of monoclonal anibodies (Mabs) against avian reovirus 1091 in chicken kidney (CK) primary cell culture were examined using plaque reduction neutralization test (PRNT).
The Mabs were produced by fusion of spleen limphocytes of Balb/c mice immunozed with the virus, with immortal limphocytes (myleoma) using 43% polyethylene glycol (PEG). The fusion of both cells produced “hybridoma” some of which produced antibodies reacted spesifically with a single epitope on the virion. This specific antibodies are known as monoclonal antibodies (Mabs). The proteins of avian reovirus 1091 reacted with the Mabs were determined by radioimmunoprecipitation and westernimmunoblotting. The neutralizing activities of the Mabs were determined by PRNT.

The result showed that Mabs 5A6 (against mB/mBC) and Mabs 5A12, 5B11 and 5C6 (against sC protein) neutralizad avian reovirus 1091 activities in CK primary cell culture. This result indicated that mB/mBC and sC protein play impotant role in the infection process and are therefore likely to be the potential candidate for the development of an immunogenic and protective vaccine

Key words: monoclonal , antibodies, avian reovirus

Pendahuluan

A
vian reovirus umumnya mudah ditumbuhkan pada biakan sel primer asal ayam seperti biakan sel ginjal ayam dan biakan sel makrofag hati ayam (Guneratne et al 1982). Biakan sel tersebut banyak dipakai untuk memperbanyak avian reovirus dan untuk mempelajari sifat?sifat biologis virus tersebut secara in vitro (Meanger 1989). Walaupun relatif lebih sulit disiapkan jika dibandingkan dengan biakan sel lestari, penentuan sifat bilogis avian reovirus pada biakan sel primer seperti biakan sel ginjal anak ayam akan lebih bermanfaat karena hasilnya akan lebih menyerupai keadaan alaminya, mengingat virus ini secara alami menyerang yam muda.(Kibenge and Wilcox, 1983) .
Penentuan protein yang berperan dalam proses netralisasi virus merupakan hal penting dalam upaya pengembangan vaksin yang imunogenik dan protektif. Salah satu cara yang sering dipakai untuk mengidentifikasi protein virus yang terlibat dalam proses netralisasi virus adalah dengan antibodi monoklonal (AbMo). Hal ini dimungkinkan karena AbMo hanya berikatan terhadap satu jenis epitop dalam suatu struktur protein sehingga fungsi protein dapat diketahui dengan cara memanipulasinya dengan AbMo (Campbell, 1991). Penggunaan AbMo seperti itu telah dilaporkan pada mammalian reovirus sehingga protein yang terlibat dalam proses netralisasi telah diidentifikasi (Hayes et al, 1981 ; Lee et al 1981a).
Seperti pada mammalian reovirus, avian reovirus memiliki 10 segmen asam inti RNA beruntai ganda dan masing?masing segmen berfungsi untuk menyandi satu jenis protein (Deshmuk & Pomeroy 1969a, b). Pada avian reovirus, sekurang-kurangnya 10 jenis protein telah didentifikasi. Berdasarkan berat molekulnya menjadi tiga kelompok besar yaitu: l (lA, lB, lC), m (mNS, mA, mB/mBC), s (sA, sB, sNS dan sC) (Schnitzer et al, 1982). Penentuan protein avian reovirus yang berperan dalam proses netralisasi virus belum banyak dilaporkan. Dalam paper ini diuraikan aktivitas netralisasi AbMo terhadap infektivitas avian reovirus 1091 pada biakan primer asal ginjal anak ayam.

Materi dan Metode

Virus
Avian reovirus 1091 yang dipakai dalam penelitian ini diisolasi dari ayam penderita runting/stunting syndrome (Pass et al 1982) dan telah diadaptasikan biakan sel Vero (suatu sel lestari yang berasal dari ginjal kera hijau Afrika) (Wilcox et al 1985).

Pembuatan Antibodi Monoklonal
AbMo terhadap avian reovirus 1091 dibuat dengan cara fusi sel limfosit mencit yang telah kebal terhadap avian reovirus 1091, limfosit imortal/sel myeloma asal mencit (P3-NS1/1-Ag4.1). Fusi kedua jenis sel menghasilkan sel hibrida (hibridoma) yang menghasilkan AbMo terhadap protein avian reovirus 1091. AbMo kemudian diproduksi dengan dua cara yaitu : pertama, menumbuhkan hibridoma dalam media penumbuh hibridoma sampai mendekati stadium kematian. Media penumbuh hibridoma, kemudian diambil dan dipakai sebagai sumber antibodi. Kedua, menyuntikan sel hybridoma ke dalam ruang abdomen mencit yang terlebih dahulu telah disuntik dengan pristane. Cairan Ascites yang terbentuk karena pertumbuhan hibridoma kemudian dipakai sebagi sumber AbMo. Kandungan AbMo dalam cairan ascites maupun dalam media penumbuh hibridoma ditentukan dengan cara titrasi dengan uji ELISA. Titer AbMo ditetapkan sebagai antilog dari pengenceran tertinggi yang masih memberikan absorbance sebanyak 50% dari absorbence optimal.
AbMo ditentukan isotipenya dengan kit (rabbit anti-mouse subtyping isotyper kit, Bio-Rad Laboratory, USA) sesuai dengan prosedur yang diuraikan oleh pembuat Kit. Sedangkan protein virus yang bereaksi dengan masing-masing AbMo ditentukan dengan uji radioimmunoprecipitation (RIP) dan uji Western immunoblotting (WIB).

Penentuan Aktivitas Netralisasi AbMo
????? ?? ????TrackBack? a ??URI???:? (Separate multiple ??URI??s with spaces.)???????? ?? ?? ?? ?? ??????WordPress bookmarklet??You can drag the following link to your links bar or add it to your bookmarks and when you “Press it” it will open up a popup window with information and a link to the site you’re curr Penentuan aktivitas netralisasi AbMo dilakukan dengan uji netralisasi penurunan jumlah plak (plaque reduction netralisation test/PNRT) pada primer ginjal anak ayam. Dalam uji ini, cairan ascites yang mengandung titer AbMo yang tinggi diencerkan berkelipatan dua dalam media DMEM tanpa serum. AbMo dari masing-masing pengenceran kemudian dicampurkan dengan media yang mengandung 100 FPU avian reovirus 1091. Setelah inkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC, masing?masing campuran dinokulasikan pada biakan sel primer ginjal anak ayam yang ditumbuhkan pada cawan petri berdiameter 60 mm. Setelah inkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC, inokulum dibuang dan sel ditutupi dengan DMEM yang mengandung agarose 1%, NBCS 5%, 200 IU/mg per ml penisilin/streoptomisin. Setelah inkubasi selama 4 hari pada suhu 37oC, 1,5 ml media DMEM yang mngandung neutral red 0,005% ditambahkan ke dalam masing-masing cawan petri. Jumlah plak pada masing-masing cawan petri dihitung. Titer netralisasi AbMo ditentukan sebagai antilog dari pengenceran tertinggi AbMo yang mampu menurunkan jumlah plak sebanyak 50% jika dibandingkan dengan kontrol tanpa AbMo.

Hasil

D
alam penelitian ini dipakai 16 AbMo yaitu AbMo 1C8 , 1F3 dan 2G9 masing-masing bereaksi terhadap protein lB, AbMo 4D1, 4E2, 3F5, 3F6, 5D10 dan 5A6 masing-masing bereaksi dengan mB/mBC, 1E9 bereaksi dengan protein sA, Mabs 5D12 bereaksi dengan protein sNS dan AbMo 4D3, 5A12, 5B11 dan 5C6 bereaksi dengan protein sC. Beberapa AbMo yang bereaksi dengan protein mB/mBC juga bereaksi dengan protein lB atau dengan protein sC. Gambar 1 memperlihatkan reaksi beberapa AbMo terhadap protein avian reovirus 1091. Sifat-sifat AbMo seperti isotipe, titer ELISA dan jenis dan berat molekul protein yang bereaksi tercantum dalam tabel 1. Dari 16 antibodi monoklonal yang diuji empat AbMo mempunyai aktivitas netralisasi terhadap avian reovirus 1091. Keempat AbMo tersebut adalah 5A6 (terhadap protein mB/BCm dan sB) dan AbMo 5C6, 5B11 dan 5A12 (terhadap protein sC). Titer netralisasi dan titer ELISA masing-masing AbMo tercantum dalam Tabel 1. Terlihat bahwa AbMo 5A6 dengan titer ELISA sebesar 217 memiliki titer netralisasi 51200 PRN50. Sementara itu, tiga AbMo anti-protein sC yaitu 5C6, 5B11 dan 5A12 dengan titer ELISA berturut-turut 217 , 226 dan 222berturut-turut memiliki titer netralisasi 51.200, 400 dan 51.200 PRN50. Sedangkan AbMo lainnya tidak memiliki aktivitas netralisasi terhadap avian reovirus 1091. Contoh penurunan jumlah plak avian reovirus pada biakan sel primer ginjal anak ayam oleh AbMo terlihat pada gambar 2.

Gambar 1. Hasil uji radioimmunopresipitasi protein avian reovirus 1091 dengan antibodi monoclonal dan poliklonal

Lisat sel terifeksi avian reovirus 1091 yang telah dilabel dengan 35-S dipresipitasi dengan AbMo . Ikatan antigen dan antibodi diisolasi dengan Protein A-Sepharose 4B dan dianalysis dengan elektroforesis dalam gel polyakrilamid yang mengandung sodium dodecyl sulfate (SDS). Gel yang dikeringkan di ekspose ke film sinar-X. Jalur 1-8, 9-12, dan 14-15 adalah lisat sel terinfeksi yang berturut-turut dipresipitasi dengan AbMo1a2, 5a12, 5b11, 5c6, 5d10, 5d12,5f6,5f5,4e2, 4d1, 1f3 dan 2g9. Jalur 9 dan 13 lisat sel terinfeksi dipresipitasi dengan serum poliklonal. Jalur 10 lisat sel normal dipresipitasi dengan serum poliklonal. Jalur 16 protein standar yang dilabel dengan 14-C sebagai penanda berat molekul

Pembahasan

D
ari uji netralisasi diperoleh hasil bahwa, 1 AbMo (5A6) terhadap protein mB/mBC, dan 3 AbMo (5C6 dan 5A12) terhadap protein sC memilki aktivitas netralisasi terhadap avian reovirus 1091 pada biakan sel primer asal ginjal anak ayam. Hal ini menunjukkan bahwa protein mB/mBC dan sC berperan dalam netralisasi avian reovirus 1091 pada biakan sel primer ginjal anak ayam.. Protein mB/mBC pada avian reovirus sangat mungkin merupakan protein kognat (asal dan fungsinya sama) dari protein m1/m1C pada mammalian reovirus. Protein m1/m1C pada mammalian reovirus, telah diindetifikasi sebagai protein fusi yang berperan dalam penyatuan partikel virus dengan membran sel inang dan antibodi terhadap protein ini telah diidentifikasi mampu menetralisasi virus (Nibert & Field 1992 ; Lucia-Jandris et al 1993). Netralisasi oleh AbMo anti-protein m1/m1C diduga akibat dari penghambatan penyatuan protein tersebut pada membran sel sehingga pelepasan asam inti (uncoating) tidak terjadi (Virgin et al 1994). Jika protein mB/mBC pada avian reovirus merupakan kognat dari protein m1/m1C pada reovirus mamalia, maka netralisasi avian reovirus oleh AbMo 5A6 mungkin disebabkan karena AbMo tersebut menghambat penyatuan virus dengan membran sel sehingga pelepasan asam inti tidak terjadi.
Tiga AbMo yaitu 5A12, 5B11 dan 5C6 (ketiganya terhadap protein sC) juga memiliki aktivitas netralisasi terhadap avian reovirus 1091 (tabel 1). Dua AbMo anti-protein sC (5A12 dan 5C6 memiliki aktivitas netralisasi yang lebih kuat (masing-masing dengan titer sebesar 51.200 PRNT50) jika dibandingkan dengan AbMo 5B11(titer sebesar 400 PRNT50). Kuatnya aktivitas netralisasi AbMo 5A12 dan 5C6 menunjukkan bahwa kedua AbMo tersebut berikatan secara langsung dengan epitop protein sC yang berperan secara langsung dalam proses perlekatan avian reovirus 1091 merupakan protein perlekatan avian reovirus dengan resptornya pada sel ginjal anak ayam.. Sementara itu, lemahnya aktivitas netralisasi AbMo 5B11 mungkin disebabkan AbMo tersebut berikatan dengan epitop protein sC yang tidak berperan secara langsung dalam proses perlekatan virus dengan reseptornya pada permukaan sel. Sehingga hanya menetralisasi virus secara tidak langsung (steric hindrance) terhadap epitop yang berperan langsung dalam proses perlekatan virus tersebut.

Protein sC avian reovirus sangat mungkin merupakan protein kognat dari protein s1 pada mammalian reovirus (Lee et al 1981b).. Protein s1 merupakan protein perlekatan yang memperantarai ikatan antara virus dengan reseptornya pada permukaan sel inang. Jika protein ini (terutama pada bagian yang berfungsi untuk membentuk ikatan dengan reseptotnya) diikat oleh antibodi, maka partikel virus tidak dapat masuk ke dalam sel sehingga proses infeksi tidak terjadi. Dengan demikian menjadi ternetralisasi. Peran yang sama s1 dalam proses netralisasi mammalian reovirus telah telah dilaporkan juga telah dilaporkan pada protein s1 yang merupakan protein perlekatan dari mammalian reovirus (Lee et al 1981b). Netralisasi avian reovirus oleh AbMo terhadap sC (5A12, 5B11 dan 5C6) memnunjukkan bahwa protein sC berperan dalam proses perlekatan virus pada membran sel inang.
Sementara itu, beberapa AbMo tidak memiliki aktivitas neutralisasi terhadap avian reovirus 1091 pada biakan sel ginjal anak ayam. Keadaan ini mungkin disebabkan karena AbMo tersebut bereaksi dengan epitop yang tidak berperan dalam proses masuknya virus ke dalam sel inang sehingga tidak mampu mencegah terjadinya infeksi.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa beberapa protein. mB/mBC dan sC berperan dalam proses netralisasi virus pada biakan sel primer asal ginjal anak ayam. Oleh karena itu, protein tersebut berpotensi untuk dapat dikembangkan sebagai bahan vaksin yang dapat merangsang terbentuknya antibodi yang protektif.

Kesimpulan
1. Antibodi monoklonal terhadap protein mB/mBC dan sC mampu mentralisasi avian reovirus 1091 pada biakan sel ginjal ayam.
2. Protein mB/mBC dan sC avian reovirus berpotensi untuk dapat dikembangkan sebagai bahan vaksin yang imunogenik dan protektif

Daftar Pustaka

Campbell AS (1991). Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology; Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology. Elsevier, Amesterdam.

Deshmuk DR & Pomeroy BS (1969a). Avian reovirus I ; isolation and serological characteriazion. Avian Dis 13:239?243.

Deshmuk DR & Pomeroy BS (1969b). Avian reovirus II ; Physicochemical characterisation. Avian Dis 13:243?251.

Guneratne JRM, Jones RC & Geogiou K (1982). Some observation on the isolation and cultivation of avian reovirus. Avian Pathol 11: 453?462

Hayes EC, Lee PWK, Miller SE & Joklik WK (1981). The interaction of series of hybridomas IgGs with reovirus particles. Demonstration that the core protein Lambda?2 is exposed on the particle surface. Virology 108: 147?155.

Lee PWK, Hayes EC & Joklik WK (1981a). Characterisation of anti?reovirus immunoglobulins secreted by cloned hybridoma cell lines. Virology 108: 134?146.

Lee PWK, Hayes EC & Joklik WK (1981b). The viral protein s1 is the reovirus cell attachment protein. Virology 108: 156?163.

ently Lucia-Jandris P, Hooper JW & Fields BN (1993). The reovirus M2 gene is associated with the properti of chromium release from L cells. J Virol 67: 5339?5345.

Meanger J (1989). Antigenic and Imunogenic Characterisation of Avian Reovirus. PhD Thesis, Murdoch University:

Nibert ML & Field BN (1982). A carboxy?terminal fragment of protein m1/m1C is present in subvirion viral infectious particles of mammalian reovirus and is proposed to have a role in penetration. J Virol 66: 6408?6418.

Pass DA, Robertson MD & Wilcox GE (1982). Runting/stunting in broiler chickens in Australia. Vet Rec 110: 386?387.

Rekik MR & Silim A (1992). Comparison of vaccine strain and field isolates of avian reovirus by T1?oligonucleotide mapping. Avian dis 36: 237?246.

Schnitzer TJ, Ramos T & Gouvea V (1982). Avian reovirus polypeptides : analysis of intracellular virus specified product, virion, top component and cores. J Virol 43; 1006?1014.

van der Heide L & Kalbac M (1975). Infectious tenosynovitis (viral arthritis) : characterization of a Connecticut viral isolate as a reovirus and evidence of viral egg transmission by reovirus?infected broiler breeder chickens. Avian Dis 19:683?688

Virgin HW, Mann MA & Tyler KL (1994). Protective antibodies inhibit reovirus internalization and uncoating by intracellular proces. J Virol 68: 6719?67?29

Wilcox GE, Robertson MD & Lines AD (1985). Adaptation and characterisation of a strain of avian reovirus in Primer asal ginjal anak ayam cells. Avian Pathol 14: 321?328.

Tabel 1. Aktivitas Netralisasi Antibodi Monoklonal terhadap Avian reovirus 1091 pada Biakan Sel Primer ginjal Anak Ayam. *Titer netralisasi AbMo yang dinyatakan sebagai PRN50. –Tidak memiliki aktivitas netralisasi.

AbMo Isotipe Titer ELISA (log 2) Protein Reaktif Aktivitas Netralisasi
1C8 IgG1 8 l.B —
1F3 IgG2a 13 lB 400*
2G9 IgG1 13 l.B —
4D1 IgG1 18 mB/mBC, mB —
4E2 IgG1 17 mB/mB/C, sC —
3F5 IgG2a 16 mB dan sB —
3F6 IgG1 17 mB/mBC, sC —
5D10 IgG2a 20 mB/mBC, sC —
5A6 IgG2a 17 mB/mBC, sB 51200
1E9 IgG2a 15 sA —
5D12 IgG2a - sNS —
1A2 IgG2b 15 sC —
4D3 IgG1 13 sC —
5A12 IgG2a 22 sC 51200
5B11 IgG2a 26 sC 400
5C6 IgG2a 17 sC 51200