Sifat Fisikokimia Bakteriosin yang Dihasilkan oleh Bakteri Staphylococcus epidermidis
(CHARACTERIZATION OF THE FISICO CHEMICAL OF BACTERIOCIN PRODUCED BY Staphylococcus epidermidis )

I Nyoman Suarsana
Laboratorium Biokimia Veteriner
Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana.

ABSTRAK
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui sifat-sifat fisiko kimia bakteriosin yang dihasilkan oleh Staphylococcus epidermidis dan aktivitas antibakterialnya terhadap bakteri Gram positif dan negatif. Hasil penelitian menun-jukkan bahwa bakteri S. epidermidis mempunyai potensi sebagai penghasil bakteriosin (substansi bakteriosin). Substansi ini diproduksi selama fase eksponensial setelah 10 jam inkubasi dan maksimum produksi tercapai setelah 26 jam inkubasi. Bakteriosin yang dihasilkan bersifat bakterisidal menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif (Micrococcus varians, Staphylococcus aureus) dan Gram negatif (Eschericia coli), mempunyai aktivitas optimum pada pH 6, bersifat thermostabil pada pH 3-5 dengan pemanasan 121oC selama 15 menit. Aktivitas bakteriosin menurun setelah diberi perlakuan dengan enzim proteolitik (protease, papain, bromelin dan ekstrak pankreas) sedangkan dengan enzim amyloglukosidase aktivitasnya tetap.

Kata-kata Kunci: Bakteriosin, sifat fisiko kimia, Staphylococcus epidermidis

ABSTRACT
The objective of this study was to determine of the physicochemical characteristics of Staphylococcus epidermidis and their antibacterial activities against Gram positive and negative bacteria. The results showed that S. epidermidis was a potential for bacteriocin production. This substance was produced during the exsponential growth phase and optimum production was observed after 10 and 26 h of cultivation, resvectively. Bacteriocin substance acted as bactericidal i.e inhibiting of Gram positive (Micrococcus varians, Staphylococcus aureus) and Gram negative (Eschericia coli) bacteria. It was thermostabile at pH 3-5 when heated at 121oC for 15 min and was sensitive to proteolitic enzimes (Protease, papain, bromelin and exctract pancreas) but insensitive to amyloglukosidase.

Key words: Bacteriocin, characteristic of physico chemical, Staphylococcus epidermidis

PENDAHULUAN

Mikroorganisme adalah penyumbang terbesar dalam menghasilkan senyawa bakteriosin dibandingkan dengan organisme lain seperti tumbuhan dan hewan. Adapun mikroorganisme tersebut adalah actinomycetes (43%), tumbuhan tingkat tinggi (23%), cendawan (15%), bakteri (9%) dan ganggag (2%) (Lisdar, 1997).
Dalam usaha untuk mencari bakteriosin baru perlu dilakukan skrining dengan mengeksploitasi dunia mikroba, mencari galur yang beragam dari habitat yang beragam, disamping seleksi galur dengan harapan akan didapat isolat baru yang dapat menghasilkan bakteriosin dengan aktivitas yang lebih baik.
Beberapa genus bakteri dapat menghasilkan bakteriosin yang kemudian lebih dikenal dengan nama bakteriosin. Bakteriosin sering diartikan sebagai protein dengan efek antagonis sebagai bakterisidal atau bakteriostatik terhadap pertumbuhan bakteri (Rodriquez, et al., 1995; Williams, et al., 1996).
Berbagai genus bakteri Gram positif maupun Gram negatif telah dilaporkan menghasilkan bakterisosin seperti genus Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococccus, Pseudomonas, dan Carnobacterium (Tagg, et al., 1976; Aymerich, et al., 1996). Bakteriosin juga ditemukan pada bakteri genus Lactococcus (Suarsana, 2000).
Barrow ( 1963) telah berhasil mengisolasi suatu senyawa bakteriosin yang kemudian dikenal dengan nama bakteriosin yang dihasilkan oleh Staphylococcus aureus tipe 71. Bakteriosin tersebut mempunyai sifat tahan panas pada kondisi asam, rusak pada suasana alkali dan inaktif dengan enzim tripsin.
Zaria (1993) juga melaporkan staphylococci koagulase negatif yang diisolasi dari kulit babi dapat menghasilkan senyawa bakteriosin yang kemudian disebut sebagai antibiotik dengan karakteristik masih aktif pada kisaran pH 2-12, bersifat stabil pada pemanasan 40-100oC, inaktif dengan enzim proteolitik dan mempunyai berat molekul 856-1400 Da.
Penelitian mengenai substansi bakteriosin dari bakteri asam laktat (BAL) telah banyak diteliti, tetapi bakteri diluar BAL seperti Staphylococcus epidermicus belum banyak dilaporkan, sehingga penelitian mengenai substansi bakteriosin yang dihasilkan terutama sifat fisikokimia dan antibakterialnya sangat perlu dilakukan dalam upaya mencari bakteriosin yang mempunyai aktivitas antibakterial berspektrum luas, baik terhadap bakteri Gram negatif dan Gram positif, juga sifat-sifat yang dimiliki oleh bakteriosin tersebut dalam upaya untuk penyimpanan, aplikasi dan menghindarkan hal-hal negatif yang dapat mengurangi aktivitas antibakterialnya.
Adapun tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui sifat-sifat fisiko kimia bakteriosin yang dihasilkan oleh Staphylococcus epidermidis dan aktivitas antibakterial terhadap beberapa bakteri Gram negatif dan positif. Hasil penelitian yang diperoleh diharapkan dapat memberi informasi dasar mengenai substansi bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri Staphylococcus epidermidis baik sifat-sifat fisikokimia maupun aktivitas antibakterialnya.

MATERI DAN METODE
Bahan-bahan dan Alat
Isolat Staphylococcus epidermidis disimpan dalam media Agar darah suhu 40C, media agar darah (blood agar base, Difco, USA), Media cair Todd Hewitt broth (THB, Difco), dan Nutrient Agar. Enzim Proteolitik (protease, papain, bromelin, protease dan ekstrak pankreas) dan amiloglukosidase. Pereaksi Molisch, pereaksi Ninhidrin, kertas filter (milipore corporation Belpord MA. 01730) diameter 0,22 mm. NaOH 0,1 M, HCl 0,1 M. Alat yang digunakan berupa: Tabung reaksi dengan raknya, ose platina, bunsen, cawan petri, gelas ukur dengan berbagai volume, pipet berbagai volume, pipet otomatis 5-50 ml, sentrifus, tabung sentrifus, inkubator, mikroskup, gelas objek, spektrofotometer, pH meter,

Metode Penelitian
Penentuan waktu optimum produksi bakteriosin dan kurva Pertumbuhan.
Pada percobaan ini dibiakkan 1% (v/v) bakteri Staphylococcus epidermicus dalam media Todd Hewith Broth (THB) umur 24 jam kedalam 25 ml media THB sebanyak 15 tabung dan diinkubasi pada suhu 370C. Setiap 2 jam inkubasi, tabung diambil kemudian diukur serapan optiknya pada panjang gelombang 620 nm dan diletakan di dalam lemari pendingin. Perlakuan ini dikerjakan sampai tabung ke-15. Selanjutnya semua biakan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Fase cair jernih yang diperoleh disterilisasi dengan filter diameter 0,22 mm dan diuji aktifitas bakteriosinnya menggunakan metode sumur (well diffusion agar). Zone hambatan yang paling luas menunjukkan waktu produksi bakteriosin yang optimum.

Karakterisasi Sifat-sifat fisikokimia bakteriosin
1. Penentuan pH optimum, pengaruh pH, Suhu dan lama pemanasan
Pada tahap ini, dibuat larutan bakteriosin dan disesuaikan pH-nya menjadi pH 3-11 dengan penambahan 0,1 M HCl untuk pH asam dan 0,1 M NaOH untuk pH basa. Sebagai pembanding dibuat larutan dengan pH yang sama seperti diatas tetapi tanpa penambahan bakteriosin. Larutan bakteriosin dengan berbagai pH tersebut diatas dibiarkan selama 1 jam pada suhu kamar dan selanjutnya diuji aktivitas bakteriosin terhadap bakteri penguji dengan menggunakan metode sumur.
Dalam uji stabilitas terhadap suhu dan lama pemanasan, larutan bakteriosin dengan berbagai pH diatas diberi perlakuan : (1). Dipanaskan 500C selama 20 menit , (2). Dipanaskan 1000C selama 20 menit dalam water bath dan (3). Diotoklaf 1210C selama 15 menit. Selanjutnya aktivitas bakteriosinnya diuji menggunakan metode sumur.

2. Pengaruh enzim terhadap aktivitas bakteriosin.
Ekstrak kasar substansi antimikroba setelah diekspose dengan enzim, selanjutnya diuji aktivitas antibakterialnya. Enzim yang digunakan adalah enzim proteolitik (papain, protease, bromelain dan ekstrak pankreas) dan enzim amiloglukosidase. Dengan menggunakan metode yang dimodifikasi dari Zaria ( 1993) dan Janes, et al. (1999), sebanyak 1 ml bakteriosin yang dilarutkan dengan buffer posfat 0,1 M ditambah masing-masing dengan 1 mg/ml enzim (papain, protease, bromelain dan amiloglukosidase) dan pH disesuaikan menjadi 7. Sebagai kontrol digunakan buffer posfat. Selanjutnya sampel diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Khusus untuk ekstrak pankreas, 1 ml bakteriosin ditambah dengan 0,2 ml ekstrak pankreas dan pH juga disesuaikan menjadi 7,5. Setelah inkubasi selama 1 jam, aktivitas enzim diinaktifkan dengan pemanasan 70oC selama 25 menit dan dibiarkan dingin. Kemudian pH disesuaikan menjadi pH 6 dan diuji aktivitas bakteriosinnya.

Pengujian Aktivitas Bakteriosin.
Uji aktifitas antibakterial bakteriosinnya menggunakan metode sumur (well diffusion agar) dengan bakteri uji yaitu: E.coli, Staphylococcs aureus, Streptococcus sp., Pseudomonas sp.dan Micrococcus varians. Caranya adalah: biakan bakteri penguji ditanam satu ose pada 5 ml media cair THB dan di inkubasi pada 370C selama 24 jam. Biakan 0,1 setara dengan jumlah bakteri 1 X 109 sel/ml diukur serapan optiknya 620 nm (Lamler, et al., 1998). Biakan diambil 0,5 ml untuk dicampur dan diratakan diatas permukaan media NA dengan gelas bengkok, kemudian dibiarkan kurang lebih 10 menit sampai inokulum kering. Kemudian dibuat lubang dengan “gel puncher” dengan diameter kurang lebih 5 mm. Sumur ini diisi dengan 30 ml bakteriosin dan dieramkan pada suhu 370C selama 24 jam. Sebagai kontrol menggunakan media cair THB steril tanpa penambahan bakteriosin. Zona terang yang terbentuk disekeliling sumur menunjukkan adanya aktifitas bakteriosin terhadap bakteri penguji. Diameter zona yang terbentuk selanjutnya diukur.

Analisis data
Data yang diperoleh dari penelitian diatas dianalisis secara deskriptif.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Fisiologi produksi dan kurva pertumbuhan S. epidermidis
Hasil pengukuran serapan optik yang diplotkan terhadap selang waktu inkubasi, diperoleh kurva pertumbuhan S. epidermidis pada media THB dan juga aktivitas antibakterial dari bakteriosin yang dihasilkan, seperti yang terlihat pada Grafik 1. Fase lag (fase penyesuaian) berlangsung selama 2 jam, fase pertumbuhan eksponensial dimulai setelah 2 jam dan fase pertumbuhan stasioner tercapai setelah 16 jam sedangkan fase kematian tercapai setelah 26 jam inkubasi. Senyawa bakteriosin mulai diproduksi setelah umur kultur 10 jam inkubasi dan produksi optimum tercapai setelah 26 jam inkubasi atau saat memasuki 2 hari inkubasi. Produksi optimum terlihat dari luasnya zona hambat yang dihasilkan.
Aktivitas bakteriosin ditunjukkan oleh zona hambatan terhadap pertumbuhan bakteri penguji yaitu M. varians. Digunakannya bakteri M. varians sebagai bakteri indikator uji, kerena pada penelitian pendahuluan, bakteri ini sensitif terhadap bakterisoin yang dihasilkan oleh S. epidermidis.

Grafik 1. Kurva Pertumbuhan dan Produksi Substansi Bakteriosin yang
Dihasilkan oleh S. epidermidis

Setelah 26 jam inkubasi produksinya mulai menurun pada saat memasuki fase kematian sel. Penyebab menurunnya aktivitas bakteriosin pada inkubasi yang terlalu lama telah dilaporkan oleh beberapa peneliti. Diantaranya oleh Dajani dan Wannamaker (1969) melaporkan inkubasi yang terlalu lama menyebabkan aktivitas bakteriosin menurun, hal ini karena pengaruh inaktivator bakteriosin yang spesifik atau kemungkinan lain oleh sifat reabsorpsi bakteriosin oleh sel produsen.
Menurut Jo et al. (1996) jika waktu inkubasi diperpanjang maka aktivitas bakteriosin menurun hal ini karena terbebasnya protease dari sel autolisis, karena bakteriosin merupakan molekul proteaneus sehingga mudah terdegradasi.

Karakterisasi sifat-sifat fisikokimia substansi bakteriosin.
Penentuan pH optimum ditentukan dari luasnya zona hambat yang terbentuk dan jernih. Hasil uji aktivitas pada berbagai pH diperlihatkan pada Tabel 2. Pada pH 6 hambat lebih luas dibandingkan dengan pH lainnya. Mengingat bakterisoin yang asli saat panen mempunyai pH 5,9 maka dapat dinyatakan aktivitas optimum bakteriosin adalah pada pH 6.

Tabel 2. Hasil penentuan pH optimum aktivitas ekstrak kasar substansi bakteriosin yang dihasilkan oleh S. epidermidis.

pH Uji aktivitas bakteriosin
diameter hambatan (mm) keterangan
34567891011 99101413.59520 ada hambatansdasdasdasdasdasdasdatidak ada hambatan

Hasil pengaruh pH, suhu dan lama pemanasan terhadap aktivitas substansi bakteriosin disajikan dalam Tabel 3.
Tabel 3. Pengaruh pH, suhu dan lama pemanasan terhadap aktivitas ekstrak kasar
substansi bakteriosin yang dihasilkan oleh S. epidermidis.

pH diameter hambatan aktivitas bakteriosin (mm)
Kontrol(tanpa bakteriosin) 50oC, 20 menit 100oC, 20 menit 121oC, 15 menit
34567891011 000000000 8,58,91413.59520 88912,5104000 7,575000000

Pada pemanasan 50oC selama 20 menit aktivitas bakteriosin masih aktif pada kisaran pH 3-10, pemanasan 100oC selama 20 menit aktivitas mulai menurun dan hanya aktif pada kisaran pH 3-8 sedangkan pada pema-nasan 121oC selama 15 menit, aktivitas bakteriosin hanya aktif pada kisaran pH 3-5.
Dari hasil pecobaan ini dapat dinyatakan bahwa bakteriosin bersifat tahan panas pada pH rendah, sedangkan pada pH alkalis bakteriosin menjadi inaktif. Hal ini menunjukkan bahwa molekul bakteriosin meregang pada pH alkalis dan proses ini dipercepat dengan suhu yang ditingkatkan, sehingga bakteriosin terhidrolisis dan daya larutnya berkurang yang berakibat aktivitas biologisnya hilang.
Perlakuan dengan enzim proteolitik menyebabkan aktivitas antibakterialnya menurun berturut-turut mulai dari ekstrak pankreas, papain, bromelin dan protease sedangkan dengan enzim amyloglukosidase aktivitasnya tetap. Hal ini menunjukkan bahwa protein adalah komponen utama dari substansi bakteriosin (Tagg et al., 1976; Janes et al., 1999)
Hasil uji pengaruh enzim terhadap aktivitas substansi bakteriosin dapat dilihat dalam Tabel 4.
Tabel 4. pengaruh enzim terhadap aktivitas antibakterial bakteriosin
No Enzim diameter hambatan (mm)
123456 Bakteriosin (tanpa perlakuan enzim)AmyloglukosidaseBromelinProteasePapainEkstrak Pankreas 141410874

Pengujian aktivitas antibakterial
Uji aktivitas antibakterial substansi bakteriosin yang dihasilkan terhadap beberapa bakteri penguji dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Aktivitas substansi bakteriosin yang dihasilkan oleh S. epidermidis terhadap beberapa bakteri penguji.

Bakteri penguji Diamater hambatan (mm)
Gram positif- Micrococcus varians- Staphylococcu . aureus- Streptococcus sp.Gram negatif- Eschericia coli- Pseudomonas sp. 14.55-4-

Dari Tabel 2, ternyata substansi bakteriosin mempunyai aktivitas antibakterial baik terhadap bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif, akan tetapi aktivitas hambatan termasuk berspektrum sempit. Branen et al., (1975) melaporkan substansi bakteriosin yang dihasilkan oleh Streptococcus diacetilactis dan Leuconostoc citrovorum dapat menghambat baik bakteri Gram positif maupun negatif. Demikian juga dengan Zaria (1993), melaporkan ekstrak kasar substansi bakteriosin yang dihasilkan oleh Staphylococcus koagulase negatif yang diisolasi dari kulit babi mampu menghambat bakteri Gram positif dan negatif.

KESIMPULAN
Substansi bakteriosin dari S.epidermidis diproduksi selama fase eksponensial setelah 10 jam inkubasi dan produksi optimum tercapai setelah 26 jam inkubasi.
Berdasarkan sifat-sifat fisokokimia, substansi bakteriosin mempunyai aktivitas terbaik pada pH 6, masih aktif pada kisaran pH 3-10, termostabil pada pH 3-5 dengan pemanasan 121oC selama 15 menit dan sensitif terhadap enzim proteolitik (protease, bromelin, papain dan ekstrak pankreas). Bakteriosin bersifat bakterisidal yaitu mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif (M. varians, S. aureus) dan Gram negatif (E. coli).

DAFTAR PUSTAKA

Aymerich, T., Holo, H., Havarstein, L.S., Hugas, M., Garriga, M. and Nes, I.F. 1996. Biochemical and Genetic Characterization of Enterocin A from Enterococcus faecium, a New Anti listerial Bacteriocin in the Pediocin Family of Bacteriocins. App. and Environ. Microbiol. 62(5): 1676-1682.

Barrow, B.I. 1963. The Nature of Inhibitory Activity by Staphylococcus aureus type 71. J. Gen. Microbiol. 32:255-261.

Branen, A.L., Go, H.C. and Genske, R.P. 1975. Purification and properties of antimicrobial substances produced by Streptococcus diacetilactis and Leuconostoc citrovorum. J. of Food Sci. 40:446-450.

Dajani, A.S. and Wannamaker, L.W. 1969. Demonstration of bactericidal substance against beta-hemolytic streptococci in supernatant fluids of staphylococcal cultures. J. bacteriol. 97:985-991.

Janes, M.E., Nannapanemi, R. and Johson, M.G. 1999. Identification and Characterization of Two bacteriocin Producing Bacteria Isolated from Garlic and Ginger Root. J. of Food Protection. 62(8):899-904.

Jo, Y.B., Kyung, M.B., Sung-Koo, K. and Hong-ki, J. 1996. Evaluation at optimum conditions for bacteriocin production from Lactobacillus sp. JB-42 isolated from kimichi. J. Microbiol. Biotechnol. 6:63-67.

Laemler, C., Wibawan, I.W.T. and Pasaribu, F.H. 1998. Ralation Between Encapsulation of Streptococci of Serological Gorub B and Adherence Properties of the Bacteria to DEAE-sephacel. Media Vet. 5(4):1-6.

Lisdar, I.S. 1997. Potensi keragaman hayati mikroorganisme dalam menghasil-kan senyawa antimikroba. Kumpulan Abstrak. Konas 7. Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia. Denpasar Bali. 8-10 Desember 1997.

Rodriguez, J.M., Cintas, L.M., Casaus, P., Suarez, A. and Hernandez P.E. 1995. PCR Detection of the Lactocin S Structural Gene in Bacteriocin-Producing Lactobacilli from Meat. App. and Environ. Microbiol. 61(7): 2802-2085.

Suarsana, N. 2000. Isolasi dan karakterisasi substansi bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri yang diisolasi dari susu sapi mastitis. Thesis Pascasarjana IPB, Bogor. 74 Halaman.

Tagg, J.R., Dajani, A.S. and Wannamaker, L.W. 1976. Bacteriocins of Gram Positive Bacteria. Bacteriol. Rev. 40(3): 722-756

Williams, R.A.D., Lambert, P.A. and Singleton, P. 1996. Antimicrobial Drug Action. Bios Scientific Publisher Ltd. Oxford, U.K. pp.:1-146.

Zaria, L.T. 1993. Antibiotic Production by Coagulase-negative Staphylococci Isolated from the Skin Pigs. 60:123-127