Amplifikasi Short Tandem Repeats pada Anjing Kintamani dengan Teknik Polimerase Chain Reaction (PCR)

(AMPLIFICATION OF SHORT TANDEM REPEATS OF KINTAMANI DOGS BY POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR) )

I Ketut Puja

Genetika dan Embriologi Veteriner
Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Udayana
Denpasar
e-mail addres : [email protected]

ABSTRAK
Telah dilakukan amplifikasi runutan nukleotida terulang atau mikrosatelit pada anjing Kintamani dengan menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR). Mikrosatelit ini dapat diamplifikasi dengan PCR dan menjadikannya sebagai penanda allel utama yang dapat digunakan untuk pemetaan gen, pengkajian genetika populasi dan identifikasi individu. Pada penelitian ini diamati keragaman mikrosatelit pada anjing Kintamani. Jumlah dan ukuran allel pada 425 anjing Kintamani dianalisis menggunakan 116 jenis primer mikrosatelit. DNA diisolasi dari sel yang diambil dari sweb pipi. Amplifikasi 116 lokus mikrosatelit dilakukan dengan PCR dalam 12 multiplek. Produk PCR dipisahkan dengan gel bis-akrilamid 6% dalam Sekuenser DNA automatis. Flurosesnsi yang dihasilkan dideteksi dengan program Genescan 3.1, dan program Strand versi 2.2.39 digunakan untuk menghitung jumlah allel. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah allel yang didapat adalah 1128. Jumlah allel perlokus berkisar antara 3 (AHT136) sampai 41 (FH2138). Rataan PIC adalah 0,68 dan semua lokus bersifat polimorfik. Metode diharapkan dapat dipakai dalam mempelajari strukur genetic anjing Kintamani.

Kata Kunci : PCR, mikrosatelit, anjing Kintamani.

ABSTRACT
A PCR based on selective amplification of repetitive sequences was used to determine short tandem repeats or microsatellites in Kintamani dogs. The microstellites can then be amplified by polymerase chain reaction (PCR), which enable the precise major allele designation both in pedigree and population surveys. This makes them applicable both for gene mapping, population genetic studies, and for individual identification. In this study, 116 primers showed to be able to detect microsatellite in 425 Kintamani dogs. DNA genome was isolated from cells collected by buccal swab. One hundreds and sixteen microsatellites were amplified by PCR in 12 multiplexes reaction. The PCR products were run on 6% bis-Acrylamide gel in automated DNA sequencer. Fluorescent signals from the dye-labeled microsatellites were detected using Genescan 3.1 software. The allele number was calculated by Strand Version 2.2.39 program. The result showed that a total of 1128 alleles were found. The number of alleles per locus ranged from 3 (AHT136) to 41 (FH2138). Mean PIC value is 0.68. All of the microsatellite loci were polymorph. The method is a promising method for studying genetic structure of Kintamani dogs.

Keywords : PCR, microsatellite, Kintamani dogs.

PENDAHULUAN
Short tandem repeats atau dikenal juga dengan sebutan mikrosatelit merupakan urutan nukleotida pendek terulang secara berurutan dalam genom eukariota. Pemberian nama ini didasarkan pada kandungan nukleotida yang biasanya terdiri dari 1 sampai 5 pasang. Motip urutan terulang yang sering dijumpai pada genom eukariota adalah (dC-dA)n – (dG-dT)n (Stalling et al.,1991). Mikrosatelit ini sangat polimorfik pada pada suatu populasi (Zajc et al.,1997) dengan angka mutasi melebihi 10-4 pada setiap generasi (Weber and Wong,1993). Keragaman mikrosatelit ini diakibatkan adanya perbedaan pada unit nukleotida terulang.
Anjing Kintamani adalah sebutan sekelompok anjing lokal jenis pegunungan yang hidup di sekitar desa Sukawana, Kecamatan Kintamani, Kabupaten Bangli, Bali. Anjing Kintamani ini memiliki ukuran tubuh yang sedang dengan tinggi rata-rata pada yang betina 44,65 cm dan 51,25 cm pada yang jantan serta berat rata-rata pada yang betina 13,14 kg dan 15,90 kg pada yang jantan (Puja, 1999). Anjing Kintamani sangat homogen dan menampakkan kesamaan satu sama lainnya (Adisaputra,1999). Anjing Kintamani termasuk omnivora atau pemakan segala. Anjing Kintamani mampu mengkonsumsi pakan seadanya seperti misalnya nasi, dedak padi, ketela maupun daging (Suryaningsing,1999) dan perilaku anjing Kintamani tidak agresif (Puja,2000).
Sampai saat ini asal anjing Kintamani belum diketahui dengan jelas. Dalam penelitian ini akan dicoba untuk mengungkap konstitusi genetik anjing Kintamani dengan teknik PCR.
Visualisasi mikrosatelit pada anjing Kintamani dengan teknik PCR akan memungkinkan menandai alel utama pada individu di dalam populasi. Oleh karena itu, mikrosatelit banyak digunakan di dalam pemetaan gen (Bruford and Wayne,1993), struktur genetik pada populasi (Canon et al.,2000; Koskinen and Bredbacka,2000.; Martines et al.,2000.; Stahberger-Saitbekova et al.,2001), dan uji paternalitik (Schnabel et al.,2000). Visualisasi mikrosatelit ini akan membantu dalam studi mengenai struktur genetik maupun menguak status trah anjing Kintamani.

MATERI DAN METODA
Pengumpulan sampel.
Sampel sweb pipi anjing diambil dengan menggunakan sikat khusus yang memungkinkan terjadinya penempelan mukosa pipi pada sikat. Sejumlah 425 anjing Kintamani yang hidup di habitatnya yaitu di Kintamani Bali diambil sebagi sampel. Pengambilan sampel dilakukan 10 sampai 15 menit pada anjing setelah minum atau makan. Sampel diambil secara acak tanpa memperhitungkan hubungan genetik satu sama lainnya.

Ekstraksi DNA
Untuk ekstraski DNA maka sweb pipi dimasukkan ke dalam botol penyimpan DNA yang mengandung larutan 50mM NaOH. Selanjutnya botol tadi dipanaskan pada suhu 950 C selama 10 menit. Setelah selesai, ditambahkan larutan Tris 1M pH8,0. DNA yang didapat dapat disimpan dalam suhu 4C.

Mikroosatellite Genotyping
Sebanyak 116 primer mikrosatelit anjing yang dibagi menjadi 12 multipleks dicoba diampilifikasikan. Reaksi amplifikasi pada PCR dilakukan pada PCT 100 (MJ Research, Inc, Watertown, Mass, USA) sebanyak 30 siklus dengan program sebagai beikut :denaturasi pada 950 C selama 10 menit, annealing pada 560 C selama 30 menit dan extension pada 720 C selama 1menit. Hasil amplifikasi dipisahkan dengan gel bis-Acrylamide 6% pada mesin DNA sequencer otomatis (ABI Prism 377 DNA Sequencer-PE Biosystem, Foster City, CA, USA). Hasil divisualisai memakai petanda floresensi dari mikrostaelit yang dilabel pewarna floresen. Hasil akan dibaca dengan menggunakan program Genescan 3.1 software (PE Biosystem ) dan Strand Version 2.2.39 digunakan untuk menghitung jumlah alel.

HASIL DAN PEMBAHSAAN

Penemuan yang luar biasa mengenai DNA telah membuat perubahan yang besar dalam biologi dan kimia. Perkembangan ini telah menyebabkan pemahaman tentang pengertian kehidupan telah berubah ke arah molekuler dan evolusi molekuler. Pohon kekerabatan (family trees) organisme yang hidup mulai bakteri sampai primata yang awalnya dibangun berdasarkan kesamaan morfologi telah ditingkatkan pemahamannya sampai ke tingkat protein (Lowenstein,1985), dan perbedaan urutan nukleotida dalm gen (Wayne and Gittleman,1995).
PCR adalah teknik yang digunakan untuk mengamplifikasikan DNA. Hasil amplifikasi ini sangat mudah divisualisikan. Kerja PCR terkait dengan sintesis DNA dari bahan yang hasilnya terjadi peningkatan penggandaan dari DNA yang digandakan.
Hasil amplifikasi mikrosatelit pada anjing Kintamani menunjukkan bahwa ditemukan adanya 1128 alel dari 116 primer mikrosatelit yang digunakan. Dari 116 lokus mikrosatelit yang digunakan, semua lokus bersifat polimorfik dengan jumlah allel bervariasi dari 3 pada primer AHT136 sampai 41 yang dijumpai pada primer FH2138. Ukuran alel yang terdeteksi hampir serupa pada setiap anjing. Hasil ini menggambarkan bahwa anjing Kintamani mempunyai kesamaan dalam konstitusi gen. Hasil penelitian pada tingkat molekuler ini sama dengan hasil penelitian analisis anatomi tulang tengkorak anjing Kintamani yang dilakukan Puja,2001. Data kesamaan genetik pada anjing Kintamani ini dapat digunakan utnuk penentuan status trah Kintamani.
Penelitian ini memberi kontribusi pada pemahaman struktur genetik dan karakterisasi secara molekuler anjing Kintamani. Dengan teknik PCR ini juga terlihat bahwa mikrosatelit teramplifikasi dapat dipertimbangkan untuk digunakan dalam penentuan trah anjing Kintamani.

UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih penulis ucapkan kepada Yayasan Yudistira Swarga, atas kerjasamanya dan Dr.Neil C.Peddersen, dari Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, UC Davis atas bimbingannya.

DAFTAR PUSTAKA
Adisaputra W.1999. Status Trah Anjing Kintamani Menurut Kajian Morfogenetik di Daerah Simpatrik (Desa Sukawana). Skripsi FKH. Unud.

Brufford M.W., and R.K. Wayne. 1993. Microsatellites and their application to population genetics studies. Curr Opin Genet Dev. 3:939-943.

Canon J., M.L. Checa., C. Carleos., J.L.Vega-Pla., M.Vallejo, and S. Dunner. 2000. The genetic structure of Spanish Celtic horse breeds inferred from microsatellite data. Anim Genet.31:39-48.

Koskinen, M.T., and P. Bredbacka. 2000. Assessment of the population structure of five Finnish dog breeds with microsatellites. Anim.Genet 31:310-317.

Lowenstein, J.M.1985. Molecular approaches to the identification of species. Am.Sci.73:541-547.

Martines, A.M., J.V. Delgado, A. Rodero, and J.L. Vega-Pla. 2000. Genetics structure of the Iberian pig breed using microsatellites. Anim Genet.31:295-301.

Puja, I.K. 2000. Maternal behavior in Kintamani bitches during lactation periods. Media Kedokteran Hewan.

Puja, I.K. 2001. The estimation of breeds status on Kintamani dogs: Using craniometry analysis. Jurnal Biologi 5:

Scnabel, R.D., T.J. Ward, and J.N. Derr. 2000. Validation of 15 microsatellites for parentage testing in North American bison, Bison bison and domestic cattle.

Stahlberger-Saitbekova, J. Schlapfer, G. Dolf, and Gaillard C. 2000. Genetics relationship in Swiss sheep breeds based on microsatellites analysis. J.Anim.Breed.Genet.118-379-387.

Stalling, R.L., A.F. Ford, D. Nelson, D.C. Torney, C.E. Hildebrand, and R.K. Myris. 1991. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in mammalian genomes. Genomics.10:807-815.

Suryaningsing, D.P.1999. Pakan Anjing Kintamani Di Desa Sukawana, Kintamani, Bangli. Skripsi, FKH.Unud.

Wayne., RK., and J.L. Gittleman.1995. The Problematic Red Wolf. Sci.Am 26-37.

Weber, J.L., and C. Wong. 1993. Mutation of human short tandem repeats. Hum Mol Genet 2: 1123-1128.

Zajc, I., S. Cathryn, Mellersh, and J. Sampson. 1997. Variability of canine microsatellites within and between different dogs breeds. Mam Genom.8:182-185.