Hubungan Ekspresi Bovine lymphocyte Antigen
dengan Kerentanan Terhadap Penyakit Jembrana pada Sapi Bali
( ASSOCIATION OF BOVINE LYMPHOCYTE ANTIGEN EXPRESSION WITH JEMBRANA DISEASE SUSCEPTIBILITY IN BALI CATTLE)

Ni Ketut Suwiti
Laboratorium Histologi
Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Udayana

ABSTRAK
Hubungan ekspresi BoLA (Bovine lymphocyte Antigen) klas I dan klas II dengan kerentanan terhadap penyakit jembrana pada sapi bali telah dilakukan pada 40 ekor sapi bali. Ekspresi BoLA diidentifikasi dengan menggunakan metode Imunositokimia yang divisualisasikan dengan antibodi monoklonal klas I (B5C) dan klas II (BAQ150A), dengan substrat Diamino benzidine (DAB). Data hasil pengamatan dianalisis dengan chi-square. Sel-sel darah putih dipisahkan dari sampel darah total dengan pemusingan. Bufycoat ditampung, dan isolasi limfosit dilakukan dengan ficoll-paque gradient dan pemusingan pada 3000 rpm selama 30 menit. Analisis dengan Chi-square menunjukkan adanya hubungan yang nyata antara ekspresi BoLA klas I dengan kerentanan terhadap penyakit jembrana pada sapi bali. Penelitian ini dapat dipakai sebagai dasar dalam penelitian pemetaan genom tentang peranan masing-masing gen BoLA dalam menentukan kerentanan sapi bali terhadap penyakit jembrana

Kata kunci : Sapi Bali, Antibodi monoklonal, Imunositokimia.

ABSTRACT
The association of class I and class II BoLA (Bovine lymphocyte Antigen) expression with jembrana disease susceptibility, was investigated in 40 bali cattle. The expression of BoLA were identified by Imunocytochemistry method using monoclonal antibodies against class I (B5C ) and class II (BAQ150A). White blood cells were separated from the samples of total blood by centrifugation. Bufycoat was collected, and lymphocytes were isolated by ficoll-paque gradient centrifugation at 3000 rpm during 30 minutes. Chi-square analysis revealed a significant association of BoLA class I expression with susceptibility of Bali cattle to Jembrana disease. This study provides a basis for the class I further studies of the role of each BoLA in jembrana disease susceptibility.

Key words : Bali cattle, monoclonal antibodies, Imunocytochemistry

PENDAHULUAN

Penyakit Jembrana adalah penyakit yang disebabkan oleh Jembrana disease virus (JDV) termasuk dalam famili Retroviridae dan sub-famili Lentivirinae (Wilcox, dkk., 1992). Tanda-tanda penyakitnya seperti demam tinggi, kebengkakan pada kelenjar limfe (prefemoralis dan preskapularis) dan diare bercampur darah.
Sampai saat ini hanya breed sapi bali yang dinyatakan rentan terhadap penyakit Jembrana. Dilapangan belum pernah dilaporkan breed sapi (murni) lainnya terserang, kecuali sapi silang yang memiliki keturunan sapi bali. Sapi-sapi Friesian Holstein (FH) madura, dan sapi ongole dinyatakan tahan (Putra, 1999). Kenyataan tersebut membuktikan adanya perbedaan kerentanan pada tiap-tiap breed sapi terhadap penyakit jembrana.
Salah satu faktor yang berperan pada kerentanan terhadap suatu penyakit adalah faktor imunogenetik. Imunogenetik adalah konsep pendekatan genetik yang mengendalikan perbedaan reaktivitas respons imun dan kerentanan tubuh terhadap suatu penyakit (Judajana, 1997). Kendali genetik tersebut akan menentukan perbedaan reaktivitas imun pada masing-masing individu dalam suatu populasi (Angyalosi, dkk. 2001). Salah satu sistem kendali genetik tersebut adalah MHC (Major Histocompatibility Complex).
MHC pada sapi disebut dengan Bovine limphocyte Antigen (BoLA), ditemukan pada permukaan sel berinti terutama pada limfosit. MHC dibedakan atas tiga klas yakni: MHC klas I, klas II dan klas III, yang setiap klas MHC tersebut mempunyai peranan yang berbeda-beda. Fungsi keseluruhan dari antigen BoLA ini berperan dalam imunitas yang berhubungan dengan kerentanan dan ketahanan terhadap suatu penyakit. BoLA klas I dan klas II mempunyai peran utama diantaranya menyajikan antigen peptida atau antigen pada sel T serta memberi sifat pada seleksi positif dan negatif pada saat perkembangannya dalam timus, sedangkan BoLA klas III berhubungan dalam mengkode pembentukan komponen protein dan sistem komplemen (Goldsby, dkk., 2000). Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui hubungan BoLA dengan kerentanan terhadap penyakit. Adanya asosiasi antara pemunculan BoLA-DRB3.2*23 dengan penyakit mastitis yang disebabkan oleh Coliforms, dan BoLA-DRB3.2*16 berasosiasi dengan kejadian Somatik CelL Score (SCS) pada sapi Holsteins di Amerika, sehingga pemunculan BoLA-DRB3 sangat potensial dipergunakan sebagai petanda genetik tingginya resiko untuk terkena penyakit (Sharif, dkk., 1998).
Terdapat bukti yang menyokong konsep alel kerentanan dan alel protektif, yang mengikat dan menyajikan epitop peptida antigen yang berbeda. Adanya perbedaan tersebut diduga berkaitan dengan timbulnya respons imun yang berbeda pada setiap spesies dengan alel kerentanan dan alel protektif yang berbea-beda.
Sampai saat ini penelitian untuk mengetahui sejauh mana faktor imunogenetik, berhubungan dengan kerentanan terhadap penyakit belum banyak diungkapkan. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengungkapkan hubungan ekspresi BoLA klas I dan klas II dengan kerentanan sapi bali terhadap penyakit Jembrana.

MATERI DAN METODA

Limfosit
Limfosit diisolasi berasal dari sapi bali yang sebelumnya diinokulasi dengan virus penyakit jembrana dan selanjutnya setelah mengamati gejala klinis dan uji serologis, selanjutnya dikatagorikan menjadi sapi bali tahan dan rentan terhadap virus penyakit jembrana. Isolasi limfosit mengikuti prosedur Wareing (1996) dengan cara sebagai berikut : Sampel darah total (whole blood) yang masih segar dipisahkan menjadi serum, sel darah merah dan sel darah putih (Buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. Proses sentrifugasi dilakukan pada 3000 rpm selama 15 menit. Lapisan sel darah putih yang berbentuk cincin putih diantara kedua cairan dipisahkan dengan menggunakan pipet Pasteur. Dimasukkan ke dalam tabung yang berisi RPMI, Setelah dicampur secara merata, dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 5 ml larutan ficolhipaque, dan selanjutnya dipusingkan dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit.
Sel pada perbatasan (interface) dipindahkan ke dalam tabung yang mengandung 7ml PBS, selanjutnya dipusing (1250 rpm, 15 menit). Supernatan yang mengandung limfosit dicuci dua kali dengan PBS (1250 rpm, 15 menit). Endapan yang diperoleh adalah sel limfosit, kemudian dipanen dengan cara membuang supernatan.

Pemeriksaan Imunositokimia
Pengamatan dilakukan dengan melihat ekspresi Bovine Limphocyte Antigen (BoLA) terhadap 100 sel limfosit, melalui pengujian dengan menggunakan MoAb. MoAb yang dipergunakan adalah B5C untuk BoLA klas I, dan BAQ150A untuk BoLA klas II, yang diperoleh dari VMRD, Pullman, WA, USA. Sel limfosit yang mengekspresikan BoLA ditandai dengan perubahan warna menjadi coklat.
Pengamatan ekspresi BoLA dilakukan dengan metode imunositokimia mengikuti prosedur Bratthauer dan Adams (1994) dengan cara sebagai berikut : Limfosit yang telah diisolasi diteteskan sebanyak 2 x 106 diatas gelas slide, ditunggu sampai kering. Preparat difiksasi dengan menggunakan aceton yang mengandung 3% H2O2 selama 15 menit, kemudian dikeringkan. Selanjutnya preparat dicuci dengan PBS 2 X 5 menit. Pada masing-masing slide, diteteskan 200 ml NRS (Normal Rabit Serum) 10% dan diteteskan MoAb sebanyak 200 ml (1 : 60) selama 60 menit. Semua slide dicuci dengan PBS pH 7,2 sebanyak 2 X 5 menit, kemudian ditambahkan H2O2 3% pada semua glas slide selama 10 menit, dan dicuci dengan PBS 2 x 5 menit. Rabit Anti Mouse (RAM) dengan perbandingan 1 : 1000 dalam NRS 10% diteteskan dan ditunggu selama 45 menit.
Semua preparat dicuci dengan PBS 2 X 5 menit kemudian celupkan ke dalam DAB selama 5 menit. Selanjutnya dicuci dengan air mengalir selama 15 menit, warnai dengan Meyers selama 5 menit. Sebelum direndam dalam alkohol absolut selama 2 X 5 menit dilakukan pencucian dengan aquadest 2 x 5 menit. Dicelupkan kedalam xylol selama 2 X 5 menit dan dilakukan mounting. Setelah kering diperiksa dibawah mikroskop dengan pembesaran 10X, 45x dan 100X.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil penelitian menunjukkan ekspresi BoLA klas I berhubungan dengan kerentanan terhadap penyakit Jembrana, sedangkan BoLA klas II mendapatkan hasil yang sebaliknya. Hal ini dapat dikatakan pemunculan BoLA klas I, dapat berperan sebagai pemicu timbulnya penyakit yang disebabknan oleh infeksi virus penyakit Jembrana. Pendapat ini didukung oleh Fleischer dan Schrezenmeier (1998), yang mempelajari ekspresi MHC akibat infeksi oleh virus Mo-MLV (Murine Leukemia Virus), dan dalam hasil penelitiannya diperoleh terjadi peningkatan ekspresi MHC klas I pada hewan coba yang diinfeksi Virus Murine Leukemia. Data hasil penelitian ekspresi antigen limfosit sapi (BoLA) klas I pada sapi bali sehat dan sakit penyakit jembrana, dapat dilihat pada Tabel 1

Tabel 1. Data ekspresi antigen limfosit sapi bali sehat dan sakit terhadap penyakit Jembrana pada BoLA klas I dengan antibodi monoklonal B5C.

Ekspresi Total
+ -
Sapi sakit 7 13 20
bali tidak sakit 17 3 20
Total 24 16 40

Data hasil penelitian ekspresi BoLA pada sapi bali selanjutnya dianalisis dengan Chi-Square, Hasil analisis (Tabel. 2) menunjukkan, adanya hubungan antara ekspresi BoLA klas I dengan kerentanan terhadap penyakit Jembrana. Dalam hal ini ekspresi BoLA pada sapi bali rentan berbeda (P

Tabel. 2. Hasil analisis
Chi-Square Test
Value Df Asymp.Sig(2-sided) Exact Sig(2-sided) Exact Sig(1-sided)
Pearson Chi-SquareContinuity CorrrectionaLikelihood RatioFisher’s Exact TestN of Valid Cases 10,417b8,43811,03540 111 ,001,004,001 ,003 ,002

a. Computed only for a 2x2 table
b. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 8,00

Tabel. 3 Data ekspresi antigen limfosit sapi bali sehat dan sakit terhadap penyakit Jembrana pada BoLA klas II dengan antibodi monoklonal BAQ150A.
Ekspresi Total
+ -
Sapi sakit 14 6 20
bali tidak sakit 15 5 20
Total 29 11 40

Data hasil penelitian ekspresi BoLA klas II dengan menggunakan monoklonal antibodi BAQ150A pada sapi bali selanjutnya dianalisis dengan Chi-Square dan hasil analisis dapat dilihat pada Tabel. 4. Hasil analisis menunjukkan, tidak adanya hubungan antara ekspresi BoLA klas II dengan kerentanan terhadap penyakit jembrana pada sapi bali Dalam hal ini ekspresi BoLA pada sapi bali rentan tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan sapi bali tahan penyakit Jembrana.

Tabel. 4. Hasil analisis
Chi-Square Test
Value Df Asymp.Sig.(2-sided) Exact Sig(2-sided) Exact Sig(1-sided)
Pearson Chi-SquareContinuity CorrrectionaLikelihood RatioFisher’s Exact TestN of Valid Cases ,125b,000,12640 111 ,7231,000,723 1,000 ,500

a. Computed only for a 2×2 table
b. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 5,50.

Gambar 1. Ekspresi BoLA pada Sel Limfosit dengan Pemeriksaan Imunositokimia Pembesaran 100x
Keterangan :
· Sel limfosit berwarna biru tidak mengekspresikan antigen limfosit sapi.
· Tanda panah menunjukkan sel limfosit berwarna coklat mengekspresikan antigen limfosit sapi.
Faktor imunogenetik dan faktor lingkungan serta perlakuan yang diberikan terhadap hewan tersebut, sangat berpengaruh terhadap kerentanan dan ketahanan individu terhadap penyakit (Angyalosi dkk., 2001). Keadaan ini berdasarkan pada kenyataan bahwa antigen BoLA tertentu, dapat bekerja sebagai reseptor untuk agen penyebab penyakit, seperti virus, toksin dan bahan asing lainnya. Kenyataan yang mendukung hal tersebut antara lain bersumber dari hasil pengamatan, yang menyatakan bahwa molekul pada permukaan sel dapat bekerja sebagai reseptor terhadap virus.
BoLA yang berasosiasi dengan penyakit mempunyai sifat imunologik yang sama dengan agen penyebab penyakit. Pernyataan ini mempunyai alasan, karena : persamaan sifat-sifat imunologik antara agen penyebab penyakit dengan antigen BoLA, maka agen penyebab dianggap sebagai diri sendiri (self) sehingga tidak terjadi respons imun, dan dengan agen tersebut menyebabkan terjadinya penyakit tanpa gangguan dari sistem imun host. Apabila agen penyebab penyakit dianggap sebagai bahan asing, maka akan menimbulkan respons imun. Oleh karena adanya persamaan sifat imunologik antara agen penyebab penyakit dengan antigen BoLA, maka respons imun juga ditujukan kepada antigen BoLA, sehingga terjadi respons autoimun dan terjadilah penyakit.
Klein dkk., (1998) menyatakan, faktor-faktor yang perlu dipahami dalam asosiasi sistem MHC dengan suatu penyakit adalah : jumlah kuantitatif variasi molekul, variasi ekspresi moleku MHC dan variasi pola sistem MHC pada berbagai populasi yang berbeda. Teori yang mendasari pengamatan empirik tentang asosiasi antigen MHC dengan penyakit, masih mengandung banyak perdebatan dan bersifat spekulatif.
Sejauh ini penelitian untuk mengetahui asosiasi atau hubungan antara BoLA dengan kerentanan penyakit tertentu berguna sebagai petanda genetik. Selanjutnya apakah keberadaan BoLA serotipe B5C salah satu faktor yang menyebabkan sapi bali rentan terhadap penyakit Jembrana, demikian juga sebaliknya ketidak hadiran/tidak munculnya serotipe BAQ150A menyebabkan sapi bali tahan terhadap penyakit Jembrana perlu dilakukan penelitian lebih lanjut.

KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan :
Ekspresi Bovine limphocyte Antigen (BoLA) klas I dengan antibodi monoklonal B5C berhubungan dengan kerentanan terhadap penyakit jembrana pada sapi bali
Saran :
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui sejauh mana keberadaan BoLA klas I berperan dalam kerentanan sapi bali terhadap penyakit jembrana.

UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terimakasih ditujukan kepada Kepala BPPV wilayah VI Denpasar dan seluruh staf serta tenaga Laboratorium Patologi dan Bioteknologi, atas bantuan dan fasilitas yang telah diberikan selama penelitian. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada Dekan Fakultas Kedokteran Hewan atas izin yang telah diberikan.

DAFTAR PUSTAKA
Angyalosi G, Neveb R, Wolowczuk I, Delanoye A, Herno J, Auriault C, 2001. HLA class II polymorphism influences onset and severity of pathology in Schistosoma mansoni-infected transgenic mice. J. Infect Immun. 69(9):5874.

Bratthauer GL, dan LR. Adams (1994). Immunohistochemistry : Antigen Detection in Tissue dalam Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology. Armed Forces Institute of Pathology American Registry of Pathology Washington, DC. Pp.1-30.

Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA, 2000. Overview of The Immune System in Kuby Immunology 4 th ed New York. W.H. Freeman and Company. Pp.3-26.

Judajana FM, 1997. Imunogenetika. Dalam Imunologi Mukosal Kedokteran Airlangga University Press. Hal. 1-25.

Klein MR, van den Burg SH, Hovenkamp E, Holwerda Am, Drijfhoout JW, Melief CJ, Miedema F, 1998. Characterization of HLA-B57 Retristec Human Immunodeficiency Virus type I Gag and Specific Cytotoxic T Lymphocyte Respons. J. Gen. Virol. 79(9):2191-2010.

Putra AAG, 1999. Bunga Rampai Penyidikan Penyakit Hewan. Balai Penyidikan Penyakit HewanWil. VI Denpasar. Hal. 198-342.

Sharif S, Mallard Ba, Wilkie BN, Sargeant JM, Scott HM, Dekkers JC, Leslie KE, 1998. Association of The Bovine Major Histocompatibility Complex DRB3 (BoLA-DRB3) alleles with Occurence of Disease and Milk Somatic Cell Score in Canadian Dairy Cattle. J. Anim. Genet. 29(3):185-93.

Wareing, S. 1996. Development of Assays to MonitorThe Cell-Mediated Immune Response to Recombinant Jembrana Disease Virus (JDV) Protein in Cattle School of Veterinary Science Murdoch University Western Australia.

Wilcox GE, Kertayadnya G, Hartaningsih N, Dharma DMN, Seharsono S, Robetson T, 1992. Evidence for Viral Etiology of Jembrana Disease in Bali Cattle. Vet.Micro. 33:367-374.