Jurnal Veteriner (Veterinary Journal) - Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana

(PREPARATION OF ANTISERA AGAINST THE HAEMAGGLUTININ OF STREPTOCOCCUS AGALACTIAE AND STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND THEIR ROLE IN ANTIADHESIN AND OPSONIN)

I Wayan Teguh Wibawan1, Eva Harlina1, Chandramaya Siska Damayanti1 dan Kamaluddin Zarkasie2

1Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Jl. Agatis, Dermaga, Bogor. Tlp. 0251-629466, Fax:0251-681137, 2staf PT Biofarma (Persero), Bandung

ABSTRAK
Dalam penelitian ini diproduksi antiserum spesifik terhadap hemaglutinin serta karakterisasi aktivitas biologiknya sebagai anti adhesin dan opsonin. Produksi anbodi hemaglutinin terhadap dua jenis bakteri Streptococcus agalactiae dan Staphylococcus aureus dengan 2 cara yakni (1) produksi antiserum hemaglutinin pada kelinci dengan cara penyuntikan hemaglutinin murni, (2) produksi antiserum hemaglutinin pada ayam dengan jalan menyuntikkan suspensi eritrosit ayam bersangkutan yang sebelumnya telah diinkubasi dengan masing-masing ekstrak hemaglutinin kedua jenis bakteri S. agalactiae dan S. aureus. Antibodi yang terbentuk dalam serum kelinci maupun ayam bersifat spesifik, hanya bereaksi masing-masing terhadap preparasi hemaglutinin yang homolog dan tidak terjadi reaksi silang antar hemaglutinin kedua jenis bakteri tersebut. Aktivitas antiserum hemaglutinin sebagai anti adhesin ditegaskan pada uji adhesi. masing-masing antibodi hemaglutinin mampu menghambat adhesi bakteri pada permukaan sel epitel mukosa ambing. Hal yang sama ditunjukkan pula hemaglutinin murni yang sebelumnya dinkubasi dengan sel epitel mukosa ambing, mampu menghambat adhesi bakteri pada permukaan sel epitel mukosa ambing tersebut. Peran antiserum hemaglutinin sebagai opsonin dipelajari pada uji fagositosis. Bakteri yang sebelumnya diinkubasikan dengan antibodi spesifik hemaglutinin ternyata lebih mudah difagositosis oleh sel radang polimorf.

Kata kunci : Hemaglutinin, antiserum, Streptococcus aureus, Streptococcus agalactiae,
adhesin, opsonin, antibodi

ABSTRACT
In this research, specific antibody against haemagglutinin was produced and the biological activities of antibody as an anti adhesion and opsonin was investigated. Spesific antibody against haemagglutinin was prepared by injecting rabbit with purified haemagglutinin of Staphylococcus aureus as well as Streptococcus agalactiae, respectively. In parallel experiment, antibody was also produced in chicken by injecting haemagglutinin extract which previously coupled with self chicken erythrocytes. Antibody reacted specifically with haemagglutinin from respective bacteria and no cross reaction was observed between haemagglutinin of S. aureus and S. agalactiae. In the adhesion assay, both antibodies inhibited the adhesion of respective bacteria on the surface of bovine mammary epithelial cells. The purified haemagglutinin previously incubated with mammary epithelial cells caused significantly the decreasing of adhesion ability of the bacteria. The opsonization activities of both antibodies was also observed in phagocytosis assay. The bacteria that has previously been incubated with specific antibody were phagocytosed in higher number by peritoneal macrophages those of without antibody incubation. The results strongly indicate that the specific antibodies against haemagglutinin contribute the inhibition of the bacterial adhesion and enhanced the phagocytosis.

Key words : Haemaglutinin, antiserum, Streptococcus aureus, Streptococcus agalactiae,
adhesion, opsonin, antibody.

TINJAUAN PUSTAKA
Streptococcus agalactiae dan Staphylococcus aureus telah sejak lama dikenal sebagai penyebab utama mastitis subklinik pada sapi perah. Mastitis (radang ambing) masih tetap merupakan masalah utama dalam peternakan sapi perah, menyebabkan kerugian yang cukup besar akibat (1) penurunan produksi dan kualitas susu serta (2) biaya penanganannya yang mahal. Mastitis yang diakibatkan oleh infeksi S. agalactiae dan S. aureus semakin sulit ditangani dengan antibiotika karena bakteri ini banyak yang resisten terhadap berbagai jenis antibiotika. Di samping itu pemakaian antibiotika yang kurang terkendali akan menimbulkan masalah baru, yaitu adanya residu antibiotika di dalam susu atau pada hasil bahan asal ternak lainnya. Untuk menghindari hal-hal tersebut di atas, strategi baru dalam pengendalian mastitis harus segera diupayakan.
Salah satu pendekatan pemecahan masalah di atas adalah pengupayaan aplikasi anti adhesin terhadap S. agalactiae dan S. aureus sebagai penyebab utama mastitis subklinik. Pada kasus mastitis, jalan infeksi bakteri ini biasanya melewati puting, duktus laktiferus dan akhirnya dapat mencapai sisterna. Patogenesa infeksi bakteri ini pada kejadian mastitis belum banyak diketahui. Diduga infeksi diawali oleh keberhasilan bakteri menembus lapisan tanduk puting lalu dilanjutkan oleh proses adhesi dan kolonisasi. Tampaknya kemampuan adhesi dan berkolonisasi bakteri pada sel epitel ambing merupakan tahap kritis untuk keberhasilan infeksi. Maka dari itu, dalam tulisan ini adhesi merupakan titik berat kajian dan selanjutnya dikaji peran antibodi spesifik terhadap hemaglutinin sebagai anti adhesin.
Proses adhesi adalah merupakan tahap awal infeksi bakteri yang berperan dalam kolonisasinya pada permukaan sel inang. Adhesi bakteri pada permukaan sel memperpendek jarak antara bakteri dengan permukaan tubuh sehingga mempermudah toksin atau metabolit lain yang dihasilkan bakteri untuk melekat pada reseptornya di permukaan sel inang. Dalam proses adhesi dikenal dua bentuk yaitu (a) adhesi yang bersifat nonspesifik dan (b) adhesi yang bersifat spesifik. Pada adhesi yang nonspesifik, perlekatan tidak melibatkan peran reseptor permukaan. Proses adhesi disebabkan karena adanya sifat hidrofobisitas agen dan perbedaan muatan listrik permukaan bakteri dengan permukaan sel inang sehingga perlekatan umumnya tidak kuat dan bersifat ireversibel. Sedangkan pada adhesi spesifik, perlekatan diperantarai oleh reseptor permukaan sel inang yang mampu berikatan dengan antigen permukaan bakteri. Antigen permukaan ini secara umum disebut adhesin dan dapat berupa fimbria, pili, kapsul atau komponen struktural bakteri lainnya (Wibawan dan Lämmler, 1991; Wibawan et al., 1992a&b; Wibawan, 1993; Shutter et al., 1996). Dari sisi inang, keberadaan reseptor adhesi pada permukaan selnya menentukan keberhasilan proses adhesi.
Pada adhesi S. aureus, dapat ditunjukkan bahwa bakteri yang memiliki hemaglutinin melekat pada sel epitel ambing dalam bentuk kelompok-kelompok kecil (cluster) dengan jumlah berkisar antara 2 hingga 5 cluster per sel epitel ambing. Sedangkan pada bakteri yang tidak memiliki hemaglutinin tidak dijumpai adanya adhesi bakteri pada sel epitel ambing. Fenomena yang serupa dijumpai pula pada adhesi S. agalactiae (Wibawan et al., 1999b).
Menarik untuk dikaji adalah suatu kenyataan tentang keberadaan hemaglutinin yang sangat rendah pada S. aureus yang diisolasi dari manusia (hanya 2 isolat dari 32 isolat) sedangkan S. aureus yang diisolasi dari susu sapi perah penderita mastitis seluruhnya menunjukkan aktivitas hemaglutinasi (Wibawan et al., 1999b). Hal yang serupa terjadi pula pada S. agalactiae , bakteri yang diisolasi dari sapi sebagian besar menunjukkan aktivitas hemaglutinasi (Wibawan et al., 1993; Wahyuni, 1998) tetapi tidak atau hanya sebagian kecil bakteri yang diisolasi dari manusia menunjukkan aktivitas ini (Kurl et al., 1989). Dari pengamatan ini dapat dikatakan bahwa hemaglutinin merupakan tanda (marker) bagi bakteri yang sangat mengandalkan kemampuan adhesi dalam proses infeksinya. Pada jenis bakteri lain, S. equi subsp. zooepidemicus kemampuan adhesinya diperantarai oleh asam hyaluronat (Utama, 1998; Wibawan et al., 1999a).

MATERI DAN METODA
Preparasi Antiserum Hemaglutinin.
Hemaglutinin yang sebelumnya telah diisolasi dan dimurnikan (@ 300-500 µg) disuspensikan dalam adjuvan (1:1) dan disuntikkan ke kelinci secara intra vena. Penyuntikan ke-dua dilakukan setelah 1 minggu dan serum dipanen 2 minggu kemudian. Spesifikasi serum diuji dengan menggunakan uji imundifusi, koaglutinasi menggunakan S. aureus Cowan I atau dengan teknik Dot-Blot (Wibawan dan Lämmler, 1990).
Paralel dengan cara di atas serum spesifik terhadap hemaglutinin dapat dilakukan dengan menyuntikkan eritrosit ayam yang telah mengikat hemaglutinin ke ayam itu sendiri, seperti yang telah dilaporkan sebelumnya (Wahyuni, 1998).

Peran Antibodi Hemaglutinin sebagai Anti Adhesin
Peran antibodi spesifik hemaglutinin sebagai anti adhesin dapat dilakukan dalam uji hambat adhesi menggunakan biakan sel ambing. Uji adhesi dilakukan menurut Valentin-Weigand et al. (1988) dengan sedikit modifikasi. Untuk ini, masing-masing bakteri diinkubasikan dengan antiserum hemaglutinin (1ml suspensi bakteri 109 bakteri/ml HBSS+100 µl antisera) selama 1 jam dalam suhu 370C. Setelah dicuci 2X dengan 3 ml HBSS, bakteri diinkubasi dengan sel epitel dengan perbandingan (sel epitel : bakteri = 1: 1000), selama 1 jam dalam penangas suhu 370 C. Preparat diwarnai dengan HE (mikroskop biasa) atau dengan FITC (mikroskop ultra violet). Jumlah bakteri yang melekat pada permukaan sel epitel kemudian dibandingkan dengan sediaan bakteri yang tidak memperoleh perlakuan (kontrol).

Fagositosis dan Peran Antibodi Hemaglutinin sebagai Opsonin
Peran antibodi spesifik hemaglutinin sebagai opsonin, dipelajari dalam uji fagositosis yang akan diterangkan kemudian. Ikatan antibodi hemaglutinin secara spesifik pada permukaan bakteri yang memiliki hemaglutinin diharapkan akan membuat bakteri lebih mudah dieliminasi oleh PMN, baik PMN yang belum dipresensitisasi maupun yang sudah dipresensitisasi dengan komponen bakteri terpilih. Aktivitas dan kapasitas fagositosis PMN sebelum dan sesudah sensitisasi dibandingkan dan demikian pula aktivitas dan kapasitas fagositosis PMN terhadap bakteri yang diopsonisasi maupun yang tidak diopsonisasi (Wibawan dan Lämmler, 1991).

Presensitisasi PMN secara in vivo
Presensitisasi PMN atau makrofag dilakukan dengan jalan menyuntikkan S. aureus ke tikus secara intra peritoneal. Booster dilakukan setelah seminggu penyuntikan pertama. Pada minggu ketiga makrofag dan PMN dipanen dari cairan peritonium. Suspensi makrofag dan peritonium dicuci 2X menggunakan 3 ml HBSS, dihitung jumlahnya dan selanjutnya dapat digunakan untuk uji fagositosis (Sanjaya dan Wibawan, 1999).

Uji Fagositosis
Uji fagositosis dilakukan dengan cara mengikubasikan 0.5 ml bakteri yang sebelumnya telah ditentukan jumlahnya (bakteri 109 bakteri/ml HBSS) dengan 0.5 ml suspensi makrofag dan PMN (106 sel/ml HBSS), direaksikan pada suhu 37ºC selama 1 jam. Setelah dicuci 2x dengan HBSS, suspensi diwarnai dengan methylen-blue, proses fagositosis diamati di bawah mikroskop cahaya. Nilai fagositosis kemudian diekspresikan dalam aktivitas dan kapasitas fagositosis. Aktivitas fagositosis adalah jumlah makrofag dan PMN yang menunjukkan proses fagositosis untuk setiap 100 makrofag dan PMN (dinyatakan dalam %). Kapasitas fagositosis adalah jumlah bakteri yang terfagositosis oleh 50 PMN yang menunjukkan aktivitas fagositosis (Wibawan et al., 1999b).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Preparasi Antiserum Hemaglutinin dan Reaksi Silang Antar Hemaglutinin
Serum spesifik terhadap hemaglutinin diperoleh dengan cara menyuntikkan preparat hemaglutinin murni pada ayam, maupun dengan ekstrak hemaglutinin dari bakteri positip yang sebelumnya dengan eritrosit ayam itu sendiri. Ayam akan membentuk antibodi spesifik hanya terhadap hemaglutinin yang menempel pada permukaan eritrosit tetapi tidak terhadap eritrositnya sendiri.
Serum spesifik terhadap hemaglutinin yang dimiliki oleh S. aureus tidak menunjukkan reaksi silang dengan ekstrak hemaglutinin yang dimiliki oleh S. agalactiae. Demikian pula sebaliknya serum spesifik terhadap hemaglutinin S. agalactiae tidak menunjukkan reaksi silang dengan ekstrak hemaglutinin S.aureus. Hal ini menunjukkan bahwa hemaglutinin S. aureus memiliki epitop imunodeterminan yang berbeda dengan S. agalactiae.

Hemaglutinin dan Sifat Adhesif Bakteri
Bakteri yang memiliki hemaglutinin menunjukkan kemampuan adhesi yang jauh lebih baik dibandingkan dengan bakteri yang tidak memiliki hemaglutinin. Kemampuan adhesi ini berkaitan dengan keberadaan hemaglutinin di permukaan sel bakteri (Tabel 1).

Tabel 1. Hubungan antara keberadaan hemaglutinin pada berbagai jenis bakteri dengan nilai adhesi pada permukaan sel epitel ambing.

*Nilai rataan adhesi dihitung dari jumlah sel bakteri yang menempel pada 20 sel epitel dengan 3 ulangan. Angka dalam kurung merupakan selang terkecil dan terbesar. P

Di samping hemaglutinin, pada S. aureus sifat mukoid bakteri berperan pula pada proses adhesi. Secara umum S. aureus yang diisolasi dari sapi perah penderita mastitis subklinik tumbuh difus dalam serum soft-agar (Suwendra, 1999). Hal ini menunjukkan bahwa bakteri diselaputi oleh kapsul polisakarida. Hasil yang serupa dikemukaan pula oleh Baselga et al. (1993), yang mengemukakan bahwa adhesi. S aureus diperantarai oleh kapsul polisakarida dan oleh reseptor protein pada permukaan sel epitel mukosa ambing. Adanya kapsul polisakarida dapat menutupi ekspresi hemaglutinin yang mungkin terdapat di bawah kapsul. Namun dalam penelitian ini 50 isolat S. aureus yang digunakan memiliki aspek kasar menandakan kapsul polisakarida yang tipis serta mampu mengaglutinasi eritrosit (Wibawan et al., 1999b). Kenyataan ini mungkin dapat menerangkan mengapa nilai adhesi S. aureus pada permukaan sel epitel ambing jauh lebih rendah dibandingkan dengan nilai adhesi S. agalactiae. Meskipun demikian nilai adhesi S. aureus yang memiliki hemaglutinin jauh lebih tinggi dibandingkan dengan yang tidak memiliki hemaglutinin. Hasil ini memberi petunjuk bahwa hemaglutinin berperan dalam proses adhesi.
Pada kasus mastitis subklinik sapi perah, adhesi adalah tahap awal infeksi yang sangat menentukan dan penting. Adhesi merupakan tahap inisiasi dari proses kolonisasi bakteri. Adhesi bakteri ini pada permukaan sel epitel ambing diduga bersifat spesifik, artinya proses tersebut diperantarai oleh reseptor hemaglutinin pada permukaan sel epitel ambing yang berikatan secara khas dengan hemaglutinin pada permukaan sel bakteri. Seperti telah dinyatakan di atas, biakan sel epitel ambing dapat dipreparasi dari reruntuhan sel epitel dalam susu sapi dan dapat dipasase berulangkali tanpa kehilangan viabilitasnya. Biakan sel epitel ambing ini kemudian dapat digunakan dalam uji adhesi dan juga sebagai sumber reseptor hemaglutinin. Berdasarkan hal tersebut di atas maka selanjutnya dilakukan pula isolasi dan karakterisasi reseptor hemaglutinin.

Peran Antibodi Hemaglutinin sebagai Anti Adhesin
Preinkubasi bakteri-bakteri yang memiliki hemaglutinin (S. agalactiae dan S. aureus) dengan antiserum hemaglutinin yang homolog mampu menurunkan nilai adhesi pada permukaan sel (Tabel 2).
Tabel 2. Uji hambat adhesi bakteri pada permukaan kultur sel epitel ambing menggunakan antiserum hemaglutinin homolog atau reseptor hemaglutinin homolog dengan teknik pewarnaan Giemsa.

* jumlah sel bakteri yang adhesi pada 20 sel epitel ambing. P Preinkubasi bakteri dengan antiserum hemaglutinin heterolog tidak menyebabkan penurunan nilai adhesi. Hal ini menunjukkan bahwa hemaglutinin sebagai adhesin hanya mampu dihambat aktivitasnya secara spesifik oleh antiserum yang homolog.

Fagositosis dan Peran Antibodi Hemaglutinin sebagai Opsonin
Pada umumnya bakteri S. agalactiae dan S. aureus yang diisolasi dari kasus mastitis subklinik mudah difagositosis oleh sel radang polimorf (PMN) karena bakteri ini umumnya tidak memiliki kapsul. Keberadaan kapsul ditentukan dengan teknik soft-agar untuk S. agalactiae dan serum soft-agar untuk S. aureus. Bakteri S. agalactiae dan S. aureus yang tidak berkapsul tumbuh kompak pada masing-masing media.
Preinkubasi bakteri dengan antiserum hemaglutinin homolog menyebabkan peningkatan nilai fagositosis. Keberadan antiserum pada permukaan sel bakteri menyebabkan bakteri lebih mudah difagositosis oleh sel PMN karena bakteri terdapat dalam bentuk teropsonisasi (Tabel 3).
Tabel. 3. Pengaruh opsonisasi anti hemaglutinin terhadap kapasitas fagositosis PMN pada bakteri S. agalactiae, S. aureus dan E. coli.

* Nilai rataan kapasitas fagositosis dihitung dari jumlah sel bakteri yang ditelan oleh 50 sel PMN dengan 3 ulangan. Angka dalam kurung merupakan selang terkecil dan terbesar.

Antiserum spesifik terhadap hemaglutinin S. agalactiae mampu meningkatkan aktivitas dan kapasitas fagositosis PMN terhadap S. aureus, bila antiserum hemaglutinin dipanen dari kelinci. Namun sebaliknya, antiserum hemaglutinin S. agalactiae yang dipanen dari ayam maupun kelinci tidak memiliki pengaruh terhadap peningkatan aktivitas dan kapasitas fagositosis PMN terhadap S. agalactiae (data tidak ditampilkan). Hal ini dapat dipahami karena S. aureus dapat berinteraksi dengan Fc-Ig kelici melalui protein A yang mungkin dimilikinya, tetapi Protein A ini tidak berinteraksi dengan Fc Ig ayam.

KESIMPULAN
Hemaglutinin pada permukaan sel bakteri S. agalactiae dan S. aureus bertanggungjawab terhadap sifat adhesif bakteri pada permukaan sel epitel ambing dan bersifat spesifik. Hemaglutinin S. agalactiae atau S. aureus tidak menunjukkan reaksi silang terhadap antibodi heterolognya. Antibodi spesifik hemaglutinin S. agalactiae atau S. aureus hanya mampu menghambat adhesi bakteri homolognya dan tidak memiliki efek hambat terhadap jenis bakteri lainnya. Antibodi spesifik terhadap hemaglutinin S. agalactiae dan S. aureus meningkatkan aktivitas dan kapasitas fagositosis sel radang poliform (PMN) terhadap bakteri homolognya.

Ucapan Terimakasih
Terimakasih disampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi,, Departemen Pendidikan Nasional yang telah membiayai penelitian ini melalui Program Penelitian Hibah Bersaing VII

DAFTAR PUSTAKA
Baselga, R., I. Albizu, M.D.L. Cruz, E.D. Cacho, M. Barberan, and B. Amorena. 1993. Phase variaton of slime production in Staphylococcus aureus: Implication in colonization and virulence. Infect. Imun. 61(11) : 4857-4862.
Kurl, D.N., S. Haataja and J. Finne. 1989. Hemagglutination activities of group B, C, D and G streptococci: Demonstration of novel sugar specific cell binding activities in Streptococcus suis. Infect. Immun. 57: 384-389.
Sanjaya, A.W. dan I W.T. Wibawan. 1999. Induksi dan aktivasi sel darah putih dan perannya dalam pencegahan mastitis subklinik pada sapi perah. Laporan Penelitian. Lembaga Penelitian Institut Pertanian Bogor.
Shutter, J., V.B. Hatcher and F.D. Lowy. 1996. Staphylococcus aureus binding to human nasal mucin. Infect Immun. 64(1): 310-318.
Suwendra, I K. 1999. Distribusi hemaglutinin Staphylococcus aureus isolat asal sapi dan manusia. Skripsi Sarjana Kedokteran Hewan. FKH-IPB.
Utama, I.H. 1998. Ekspresi fenotip dan aktivitas biologi streptokokus grup C isolat asal babi dan kera. Disertasi Doktor, Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Valentine-Weigand, P., G. S. Chhatwal and H. Blobel. 1988. Adherence of streptococcal isolates from cattle and horses to their respective host epithelial cells. Am. J. Vet. Res. 49: 1485-1488.
Wahyuni, A.E.T.H. 1998. Peran Hemaglutinin Streptococcus agalactiae dalam proses adhesi pada sel epitel ambing sapi. Thesis Pascasarjana-IPB.
Wibawan, I W. T. and Ch. Lämmler. 1990. Properties of Group B Steptococci with Protein surface Antigen X and R. J. Clin. Microbiol. 28; 2834-2836.
Wibawan, I W. T. and Ch. Lämmler. 1991. Influence of capsular neuraminic acid on properties of streptococci of serological group B. J. Gen. Microbiol. 137: 2721-2725.
Wibawan, I W. T., Ch. Lämmler, Y. Lautrou and U. Ch. Warsa. 1992a. Serotyping and Further characterization of Group B Streptococcal Isolates from Indonesia. Zbl. Bakt. 277: 260-266.
Wibawan, I W. T., Ch. Lämmler and F. H. Pasaribu. 1992b. Role of hydrophobic surface proteins in mediating adherence of group B streptococci to epithelial cells. J. Gen. Microbiol. 138: 1237-1242.
Wibawan, I W. T., Ch. Lämmler, R. S. Seleim and F. H. Pasaribu. 1993. A hemagglutinating adhesin of group B Streptococci isolated from cases of bovine matitis mediates an adherence to HeLa cells. J. Gen. Microbiol. 139: 2173-2178.
Wibawan, I W.T. F.H. Pasaribu, I.H. Utama, A. Abdoelmawjood and Ch. Laemmler. 1999a. The role of hyaluronic acid capsular material of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus in mediating adherence to HeLa cells and in resisting phagocytosis. Res. Vet. Sci. 67:131-135.
Wibawan, I W. T., M. Sudarwanto, E. Harlina, K. Zarkasie. 1999b. Preparasi dan penggunaan vaksin polivalen sebagai pendekatan baru pencegahan mastitis pada sapi perah. Laporan Hasil Penelitian Hibah Bersaing Perguruan Tinggi II Tahap-I.