(THE cDNA SEQUENCE OF VP2 PROTEIN IN THE HYPERVARIABLE REGION OF INFECTIOUS BURSAL DISEASE ISOLATED FROM BALI)
I G. Ngurah K. Mahardika
Laboratorium Virologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana
Jl PB Sudirman, Denpasar; Telp : 0361 – 223791, 701808; Faksimili: 701808
Email: [email protected]

ABSTRAK
Sekuens nukleotida (nt) dan asam amino (aa) turunannya dari bagian yang hipervariabel pada protein struktural VP2 dari dua (2) isolat virus Infectious Bursal Disease (IBD) asal Bali dilaporkan dalam artikel ini. Isolat yang digunakan diperoleh dari wabah lapangan pada peternakan komersial yang telah divaksinasi IBD dari Karangasem – Bali, terjadi tahun 1997 dan Negara – Bali, 1998. Sebagai pembanding, satu isolat dari Tasikmalaya – Jawa Barat, 1998, juga dipelajari. Untuk selanjutnya, isolat-isolat tersebut secara berurutan dinamakan Kar97, Neg98, dan Tas98. Molekul RNA serat ganda (double stranded/ds-RNA) yang dipisahkan dari Bursa Fabricius (BF) dari ayam yang diinfeksi secara percobaan digunakan sebagai bahan dasar dalam penelitian ini. Sintesis dan amplifikasi complementary DNA (cDNA) secara in-vitro dengan Reverse Transctriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Produk RT-PCR selanjutnya secara langsung di-sequencing menggunakan MegaBASE 1000 sequencer (Amersham Pharmacia Biotech) dan PHRED base calling algorithm (STATEN Software Package). Sekuens cDNA yang diperoleh serta turunan asam aminonya dianalisis dengan MegAlign Program (DNASTAR). Informasi sekuens cDNA dari ketiga isolat pada tingkat nt dan aa menunjukkan bahwa ketiganya mirip satu sama lainnya. Derajat homologi antar isolat berkisar antara 97.9% - 99.0%. Disamping itu, perbedaan nt terdistribusi merata sepanjang fragmen. Akan tetapi perbedaan nt yang menyebabkan perbedaan aa terkonsentrasi pada ujung-5’. Satu perbedaan aa yang lain berlokasi pada ujung-3’. Semua perbedaan nt dibagian tengah fragmen merupakan mutasi silent. Berdasarkan data yang tersedia, disimpulkan bahwa ketiga isolat di atas tampaknya berevolusi dari satu virus asal yang sama, serta tergolong sebagai isolat yang virulen.

Kata-kata kunci: Sekuens cDNA, Protein VP2, Virus Infectious Bursal Disease, Bali

ABSTRACT

The nucleotide (nt) and its deduced amino acid (aa) of the hypervariable region of the structural protein VP2 of two infectious bursal disease (IBD) virusisolates originated from Bali are reported in this article. The two IBD viruses were isolated from the outbreaks of IBD in a commercial farms in Karangasem (1997) and Negara (1998) that have previously been vaccinated with IBD vaccine. An IBD virus isolate originated from Tasikmalaya (West Java) was also used in this study. The three IBD virus isolates were then respectively designated as Kar97, Neg98, and Tas98. Viral double-stranded RNA (ds-RNA) of the three isolates were extrated from Bursa Fabricius of experimentally infected chicken. The complementary DNA (cDNA) of viral RNA produced and amplified using Reverse Transctriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technique. The RT-PCR product was then sequence using MegaBASE 1000 sequencer and PHRED base calling algorithm. The nucleotide sequence of the cDNA and its deduced amino acid were analysed using MegAlign Program (DNASTAR). The sequence analysis showed that the three isolates were similar with degree of homology among the different isolates ranged from 97.9% - 99.0% indicating that the three isolates were mutated from the same virus and they were all virulent IBD viruses.

Key words: cDNA sequences, Protein VP2, Virus Infectious Bursal Disease, Bali

PENDAULUAN
Virus Infectious Bursal Disease (IBD) adalah salah satu dari agen penyakit penting bagi industri peternakan ayam dunia. Virus ini menghancurkan sumber limfosit B penghasil antibodi di bursa fabricius (BF). Gangguan pasokan sel B yang berat bertanggungjawab dalam penyakit akut dan fatal dengan infeksi oportunistik dan/atau penekanan respon kebal pada hewan yang selamat (Kaeufer dan Weiss 1980; Becht dan Mueller 1991).
Wabah IBD masih sering dilaporkan dari seluruh dunia sekalipun vaksin komersial telah digunakan secara luas. Hal ini diduga karena munculnya varian yang sangat virulen (very virulent/vv) yang dapat mengatasi antibodi yang diinduksi oleh vaksin. Virus-virus ‘baru, tersebut ternyata secara genetik berbeda dengan virus IBD klasik (Brown dkk. 1994; Yamaguchi dkk. 1996; Chen dkk. 1998).
Virus IBD dari Indonesia juga telah diisolasi dan dikarakterisasi (Parede dkk. 1995; Soejodono dkk. 1995). Informasi genetik dari beberapa isolat juga telah dipetakan. Informasi tersebut mengdikasikan bahwa vvIBD juga beredar di Indonesia (Rudd dkk. 2002; Parede dkk. 2003).
Tulisan ini mengulas tentang informasi sekuen nukleotida (nt) dan asam amino (aa) turunan dari bagian yang hipervariabel protein VP2 dari beberapa isolat virus IBD asal Bali. Fragmen gen ini dipilih dengan dasar bahwa gen ini dikenal membawa domain-domain penting untuk induksi kekebalan dan virulensi virus IBD (Azad dkk. 1987; Becht dkk. 1988; Schnitzler dkk. 1993).

MATERI DAN METODE

Tiga isolat virus IBD digunakan dalam penelitian ini. Isolat-isolat tersebut dinamakan Kar97, Neg98, dan Tas97, dan berasal dari kasus wabah pada peternakan ayam yang telah divaksinasi IBD di Karangasem-Bali, Negara-Bali, dan Tasikmalaya. Angka dibelakang nama menunjukkan tahun isolasi masing-masing virus.
Suspensi 10% organ BF dalam PBS dan Penisilin (2.000 IU/ml) dan streptomisin (2.000 μg/ml), setelah dilewatkan pada ultrafilter yang berukuran 220 nm (Milipore), diinokulasikan pada membran korioalantois telur ayam bertunas (TAB) berumur 12 hari. Pada hari ke-4 pasca infeksi, embryo dan membran dihomogenisasi dan diinfeksikan secara oral pada anak ayam yang berumur 4 minggu. Infeksi percobaan ini menyebabkan kerusakan total arsitektur BF tanpa disertai gejala klinis yang jelas (Supriyanto 1997).
Dari suspensi 10% organ BF hewan percobaan tersebut, genom virus IBD diisolasi menggunakan teknik ekstraksi fenol dan presipitasi etanol dalam suasana asam (Sambrook dkk. 1988) setelah sebelumnya didigesti dengan proteinase K dalam sodium dodesil-sulfat (SDS) 1%. Pelet hasil isolasi disuspensikan dengan akuabides yang telah diperlakukan dengan dietil-firo-karbonat (DEPC).
Sintesis dan amplifikasi in-vitro cDNA virus IBD dari bahan dasar yang telah dimurnikan tersebut dilakukan dengan reverse-transcriptase – polymerase chain reaction (RT-PCR) yang baku. Untuk maksud tersebut, telah digunakan pasangan primer oligonukleotida FP dan BP dengan urutan masing-masing sebagai berikut:

FP: 5’-ATGG(G/C)TTGAGTC(C/T)GCAACAGC-3’
BP: 5’-AGGATT(C/T)GG(A/G)ATCAGCTCGAAG-3’.

Urutan ini diharapkan komplementer dengan gen VP2 pada posisi nt 556-577 untuk FP dan 1.263-1.241 untuk BP berdasarkan publikasi Bayliss dkk. (1990). RT-PCR dilakukan dengan menggunakan Moolony Murine Leukemia Reverse Transcriptase (Superscriptâ„¢II) dan Taq-DNA Polymerase (Gybco BRL).
Produk RT-PCR selanjutnya secara langsung di-sequencing menggunakan MegaBASE 1000 sequencer (Amersham Pharmacia Biotech) dan PHRED base calling algoritm (STATEN Software Package). Sekuens cDNA yang diperoleh serta turunan asam aminonya dianalisis dengan MegAlign Program (DNASTAR). Untuk meniadakan kesalahan sintesis DNA oleh enzim, urutan nt diputuskan berdasarkan sekuens tiga produk PCR yang terpisah.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Protein struktural VP2 telah dikenal sebagai kompartemen kapsid virus IBD. Epitop yang bertanggung-jawab dalam menginduksi kekebalan protektif terhadap virus juga berlokasi pada protein ini (Azad dkk. 1987; Becht dkk. 1988; Schnitzler dkk. 1993). Domain yang paling imonogenik dan patogenik juga telah dipetakan berada di bagian tengah VP2 yang kemudian dikenal sebagai wilayah hipervariabel (Azad dkk. 1987; Schnitzler dkk. 1993). Protein ini juga mempunyai epitop yang bereaksi silang (Mahardika dan Suaryana 1997). Sedangkan protein yang kedua, VP3, tidak banyak berperan menginduksi kekebalan dan hanya membawa epitop yang spesifik serotype dan epitop yang bereaksi silang (Oepling dkk. 1991; Mahardika dan Becht 1995). Berdasarkan hal tersebut, sebagian besar laporan tentang isolat-isolat virus IBD yang baru didasarkan pada protein VP2.
Fragmen gen VP2 dari ketiga isolat yang dipelajari diatas berhasil disintensis dan diamplifikasi (Gambar 1). Urutan nt-nya juga berhasil diungkap. Contoh hasil sequencing ditampilkan pada Gambar 2. Keputusan tentang urutan nt satu isolate didasarkan pada hasil sequencing tiga produk RT-PCR yang terpisah. Ringkasan hasil komparasi urutan nt dan aa cDNA dari ketiga isolat ditampilkan pada Tabel 1. Sedangkan sekuens aa daerah hipervariabel VP2 (antara posisi aa 183-354) virus IBD asal Indonesia dibandingkan dengan virus IBD baku f52-70 (Bayliss dkk. 1990) dapat dilihat pada Gambar 4.

Tabel 1. Perbedaan Nukleotida dan Asam Amino Virus IBD Isolat(1) Kar97, Neg98,
dan Tas98

Keterangan:
Nama isolat(1) menunjukkan asal kasus dan tahun virus yang bersangkutan diisolasi, yaitu masing-masing Karangasem-Bali, Negara-Bali, dan Tasikmalaya-Jawa Barat; Pemberian nomor pada masing-masing posisi(2) berdasarkan publikasi Bayliss dkk. (1990). Penamaan asam amino(3) berdasarkan pada nomenklatura penulisan yang baku kode tiga huruf (triple letter codes for amino acid) (Sambrook dkk. 1988).

Gambar 1. Foto dokumentasi hasil RT-PCR Virus IBD Isolat Bali setelah elektroforesis pada gel agarose 1%. Jalur M: Marker Tangga 100 bp (Ladder Mix Promega); Jalur 1: Hasil RT-PCR tanpa RNA (kontrol negatif). Jalur 2, 3, dan 4: Hasil RT-PCR dengan template RNA isolat Kar98, Neg98, dan Tas98; Bp: Panjang fragmen marker dalam pasangan basa (base pairs); Panjang beberapa fragmen marker ditunjukkan

Informasi sekuens cDNA dari ketiga isolat pada tingkat nt dan aa menunjukkan bahwa ketiganya mirip satu sama lainnya dengan derajat homologi antara 97.9% - 99.0%. Disamping itu, perbedaan nt terdistribusi merata sepanjang fragmen. Akan tetapi perbedaan nt yang menyebabkan perbedaan aa terkonsentrasi pada ujung-5’. Satu perbedaan aa berlokasi pada ujung 5’. Semua perbedaan nt dibagian tengah fragmen merupakan mutasi silent.
Seperti diketahui, beberapa domain dari VP2 dianggap oleh para ahli IBD sebagai sangat krusial dalam menentukan keganasan dan imunogenitas galur atau isolat. Domain-domain tersebut adalah dua daerah hidrofilik mayor A dan B, serta dua daerah hidrofilik minor 1 dan 2 (Lihat Gambar 3). Daerah hidrofilik mayor A dan B dianggap membentuk suatu epitop penetralisasi yang non-linier (Schnitzler dkk. 1993), sedangkan daerah-daerah hidrofilik minor dianggap signifikan dalam patogenesitas virus (Van den Berg dkk. 1996). Disamping itu, fragmen heptapeptida dengan motif kaya serin S-W-S-A-S-G-S yang terletak di dekat daerah B juga telah diketahui berperan penting dalam patogenesitas virus IBD (Haine dkk. 1991).

Gambar 2.Contoh Hasil Sequencing Produk RT-PCR Virus IBD Isolat Bali. Pada Gambar ini ditunjukkan hasil sequencing empat (4) produk RT-PCR yang dilakukan secara terpisah dari RNA isolat Kar97. Dibagian atas ditunjukkan sekuens cDNA virus IBD standar F52-70. Hasil ini menunjukkan konsistensi perbedaan nukleotida antara Kar97 dengan F52-70 pada empat posisi (ditunjukkan dengan tanda panah).

Kecuali daerah hidrofilik mayor A, semua domain tersebut stabil pada ketiga isolat asal Indonesia yang dipelajari dalam penelitian ini. Ketiganya menunjukkan homologi 100% dengan galur virulen baku f52-70 (Bayliss dkk. 1990). Disamping itu, motif kaya serin S-W-S-A-S-G-S juga persis sama dengan virus IBD galur virulen.
Daerah hidrofilik mayor A tampaknya khas bagi isolat Indonesia (lihat Gambar 4). Asam amino no. 222 pada wilayah ini adalah serin (S) pada isolat Kar/97, Ngr/98, dan Tas/98, sedangkan pada virus f52-70 adalah proline (P). S222 ini dapat menjadi kandidat penanda (‘marker’) virus IBD Indonesia.

Gambar 3. Sekuens cDNA Bagian Hipervariabel Protein VP2 Virus IBD yang Diisolasi di Indonesia. Posisi nomor 1 pada sekuens diatas sama dengan posisi nomor 600 berdasarkan publikasi Bayliss dkk. (1990). Pertukaran nukleotida pada suatu posisi ditunjukkan dengan perbedaan nt berdasarkan sekuens isolat Kar97. Titik-titik menunjukkan kesamaan nt

Gambar 4. Sekuens Asam Amino Daerah Hipervariabel VP2 (antara posisi aa 183-354) isolat virus IBD Asal Bali (Kar97 dan Neg98) dibandingkan dengan virus IBD asal Jawa Barat (Tas98) dan virus virulen baku f52-70 (Bayliss dkk. 1990). Daerah-daerah yang ditandai kotak gelap merupakan daerah yang dikenal sebagai domain kritis dari VP2; yaitu domain hidrofilik mayor A dan B, domain hidrofilik minor 1 dan 2, serta domain heksapeptida kaya serin. Titik-titik pada sekuens aa dari isolat Indonesia menunjukkan aa yang identik dengan f52-70. Sekuens virus baku tersebut diperoleh dari GeneBank dengan Accession Number D00869. Nama asam amino ditulis berdasarkan nomenklatura baku kode satu huruf (Sambrook dkk. 1988).

Hasil diatas menunjukkan bahwa isolat asal Bali tersebut khas virus IBD virulen. Pada tingkat asam amino, isolat asal Bali Kar97 dan Neg98 dan Jawa Barat Tas98 sangat dekat satu sama lain. Fakta ini menunjukkan bahwa ketiga isolat kemungkinan besar berasal dari satu virus IBD asal yang sama.

UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian ini merupakan bagian dari proyek URGE Batch II Departemen Pendidikan Nasional Indonesia 1997-1999. Analisis molekuler dilakukan di Institut fuer Virologie, Giessen University, dengan dukungan penuh dari Deutscher Akademische Austauschdienst (DAAD) dibawah supervisi Dr. Juergen A Richt.

DAFTAR PUSTAKA

Azad A., M.N. Jagadish, M.A. Brown, P.J. Hudson. 1987. Deletion mapping and expression in Escherichia coli of the large genomic segment of a birnavirus. Virology. 61(1):145-52.
Bayliss CD., U. Spies, K. Shaw, R.W. Peters, A. Papageogiou, H. Muller, M.E. Boursnell. 1990. A comparison of the sequences of segment A of four infectious bursal disease virus strains and identification of a variable region in VP2. J Gen Virol. 71 (Pt 6):1303-12.
Becht H, and H. Muller. 1991. Infectious bursal disease—B cell dependent immunodeficiency syndrome in chickens. Behring Inst Mitt. 89: 217-25.
Becht H., H. Muller, and H.K. Muller. 1988. Comparative studies on structural and antigenic properties of two seroptypes of infectious bursal disease virus. J Gen Virol. 69 (Pt 3):631-40.
Chen HY, Q. Zhou, M.F. Zhang, J.J. Giambrone. 1998. Sequence analysis of the VP2 hypervariable region of nine infectious bursal disease virus isolates from mainland China. Avian Dis. 42(4):762-9.
Heine HG., M. Haritou, P. Failla, K. Fahey, and A. Azad. 1991. Sequence analysis and expression if the host protective immunogen VP2 of variant strain of infectious bursal disease virus which can circumvent vaccination with standard type I strains. J Gen Virol. 72 (Pt 8):1835-43.
Kaufer I, and E. Weiss. 1980. significance of bursa of Fabricius as target organ in infectious bursal disease of chickens. Infect Immun. 27(2):364-7.

Mahardika GN and H Becht 1995. Mapping of cross-reacting and serotype-specific epitopes on the VP3 structural protein of the infectious bursal disease virus (IBDV). Arch Virol. 140(4):765-74.
Mahardika, IGNK dan K.G. Suaryana. 1997. Ekspresi Ujung Amino VP2 Virus Gumboro pada Eschericia coli. Buletin Sains Veteriner . XIII (15): 13-15.
Oeppling V., H. Mueller and H. Becht. 1991. The structural polypeptide VP3 of infectious bursal disease virus carries group– and serotype-specific epitopes. J. Gen. Virol. 72: 2275-2278.
Parede L., P. Ronohardjo, H. Hamid, R. Indriani, Sudarisman, I. Salihin, dan Kusnaedi. 1995. Isolation and characterization of infectious bursal disease virus isolated from acute Gumboro outbreaks. Penyakit Hewan, 47:20-24.
Parede LH., S. Sapats, G. Gould, M. Rudd, S. Lowther , and J. Ignjatovic. 2003. Characterization of infectious bursal disease virus isolates from Indonesia indicates the existence of very virulent strains with unique genetic changes. Avian Pathol. 32(5):511-8.
Rudd MF., H.G. Heine, S.I. Sapats, L. Parede, and J. Ignjatovic. 2002. Characterisation of an Indonesian very virulent strain of infectious bursal disease virus. Arch Virol. 147(7):1303-22.
Sambrook J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1988. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Schnitzler D., F. Bernstein, H. Muller, and H. Becht. 1993. The genetic basis of the antigenicity of the VP2 protein of the infectious bursal disease virus. J Gen Virol. 74(Pt 8):1563-71.
Soejoedono R R., M. Partadiredja, dan C.S. Leksono. 1995. Serological Character of some Gumboro virus isolates from highly populated chicken farming area in Indonesia, Hemerazoa 77:106-110.
Supriyanto D. 1997. Perubahan Patologik Bursa Fabricius Ayam Pedaging Akibat Infeksi Virus Penyakit Bursa Menular Isolat Bali. Skripsi. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, Denpasar.
Van Den Berg TP, M Gonze D, Morales and G. Meulemans. 1996. Acute infectious bursal disease in poultry: immunological and molecular basis of antigenecity of a highly virulen strain. Avian Pathology. 25(4): 751-768.
Yamaguchi T., M. Ogawa, Y. Inoshima, M. Miyoshi, H. Fukushi, K. Hirai. 1996. Identification of sequence changes responsible for the attenuations of highly virulent infectious bursal disease virus. Virology. 223(1):219-23.