Jurnal Veteriner (Veterinary Journal) - Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana

Deteksi Antibodi Newcastle Disease pada Itik Bali Menggunakan Metode ELISA dan Western Blotting
(DETECTION OF NEWCASTLE DISEASE ANTIBODY OF BALI DUCKS USING ELISA AND WESTERN BLOTTING METHOD)

A A Ayu Mirah Adi,1 I B O Winaya 1,I Made Kardena 1, I W Suardana 2, I N Suarsana3, Iwan H Utama3 , N. M Asatawa4, IGM Krisna Erawan5 , I A Pasti Apsari 6, Y Hayashi 7Yasunobu Matsumoto7

1. Laboratorium Patologi FKH-UNUD 2 Lab. Kesmavet FKH-UNUD 3Lab. Biokimia FLH-UNUD 4. Lab. Virologi FKH-UNUD 5. Lab. Ilmu P. Dalam FKH-UNUD 6 Lab. Parasitologi FKH-UNUD.,Laboratory of global animal resource science, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

ABSTRAK
Studi Seroepidimiologi terhadap infeksi Virus Newcastle Disease (NDV) pada itik Balitelah dilaksanakan . Sampel sera sejumlah 119 behasil dikumpulkan dan diperiksa keberadaan anti-NDV antibodinya menggunakan ELISA dan western immunoblotting. Sejumlah 109 sampel (91,6%) dari 119 serum tersebut memiliki nilai OD490 diatas level kontrol. Hasil yang positif juga telah dikonfirmasi lebih jauh dengan uji western immunoblloting. Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa itik Bali dapat diinfeksi oleh virus ND dan itik Bali dapat berpotensi sebagai karier intuk infeksi ND pada hewan lain yang rentan seperti ayam.

Kata Kunci: Elisa, Western Blotting, Antibodi, Newcastle Disease, Itik Bali

ABSTRACT
An seroepidemiological study on Newcastle disease virus (NDV) infection in Bali duck has been carried out. A total of 119 samples of duck sera were collected and examined by ELISA and Westernimmunoblotting techniques for the presence of anti-NDV antibody. As many as 109(91,6%) out of 119 ducks sera showed OD 490 above control level in ELISA detecting anti-NDV antibodies and the positive results were further confirmed by western immunoblotting. The result showed that ducks could be infected by NDV and therefore a potential carrier for NDV infection in susceptible animal such as chickens.
Keywords: Elisa, Western Blotting, Antibodi, Newcastle Disease, Bali duck

PENDAHULUAN
Newcastle Disease (ND) merupakan salah satu penyakit unggas yang masuk kedalam daftar A dari OIE /Office International des Epizootica(OIE,2000 ), yaitu penyakit yang menyebar dengan cepat,menembus batas negara, menyebabkan konskuensi sosio-ekonomis dan implikasi perdagangan global.
Penyakit ini merupakan penyakit menular yang bersifat akut dan epidemik (mewabah) yang disebabkan oleh virus. Virus penyebabnya adalah golongan Paramyxovirus dari famili paramyxoviridae. Penyakit ini sangat merugikan bagi usaha pemeliharaan ternak ayam, khususnya pada pemeliharaan ternak yang dilaksanakan dengan sistem ekstensif (tradisional). Kerugian akibat penyakit ini diperkirakan 340 milyar rupiah pertahun (Sudrajat, 1996)
Virus ND sangat patogen dan V protein merupakan salah satu protein yang menentukan virulensi virus (Huang, et al.,2003) sementara itu hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein merupakan protein yang memegang peranan penting dalam proses infeksi (Huang, et al.,2004).
Hampir semua spesies unggas peka terhadap infeksi ND, tetapi ayam adalah spesies yang paling peka (Young, et al.,2002). Laporan tentang kasus penyakit ND pada ayam dan penelitian penyakit ini sudah banyak dilakukan. Namun penelitian tentang kasus penyakit ini pada spesies unggas lainnya seperti itik khususnya itik Bali sangat jarang. Dari beberapa buku disebutkan bahwa itik dapat terserang ND namun tingkat keparahannya tidak separah kejadian pada ayam dan bahkan disebutkan bahwa itk bertindak sebagai karier ND.
Mengingat sistem peternakan di pedesaan di Bali kebanyakan merupakan sistem peternakan tradisional dan dalam satu rumah tangga biasanya dipelihara lebih dari satu jenis ternak dalam jumlah yang tidak terlalu banyak (Suardana dan Suarsana,2003 belum dipublikasikan) maka adanya wabah ND pada ayam kemungkinan erat ada hubungannya dengan itik sebagai reservoirnya.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adakah itik Bali yang terinfeksi ND, dengan cara melacak keberadaan antibodi pada serumnya. Metode yang dipergunakan utnuk melacak antibodi tersebut adalah metode Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA) dan Western Imunoblotting. Sampel darah diambil dari itik yang dipelihara secara tradisional di daerah pedesaan yang tidak pernah memvaksinasi itik maupun ayamnya dengan vaksin ND. Sehingga, adanya antibodi ND pada sampel yang diperiksa menandakan bahwa itik itu pernah terinfeksi virus ND bukan akibat vaksinasi .

MATERI DAN METODE

Tempat penelitian
Penelitian ini dilakukan di Lab UPT Biomedika FKH Unud dan pemeriksaan antibodi menggunakan Elisa dan Western Blotting dilakukan di Lab of Global Animal Resource Sciences The University of Tokyo.

Pengambilan dan Penyiapan serum
Sampel darah diambil dari itik Bali yang dipelihara secara tradisional didaerah Sangeh dan Carangsari Kab. Badung serta Padangsambian Denpasar . Itik dikelompokan menjadi dua kelompok yakni itik muda dan dewasa . Sampel itik muda yakni yang berumur antara 2-3 bulan , yang dapat dikumpulkan adalah 22 sampel. Sementara itu sampel dari itik dewasa yakni itik yang telah berproduksi sampai yang akan diafkir berjumlah 97 ekor.
Darah diambil dari vena brachialis (vena di bagian sayap),menggunakan dispossible syringe 2,5 CC yang digunakan sekali pakai. Darah ditampung dalam sebuah tabung reaksi, didiamkan semalam pada lemari pendingin, kemudian serum dipisahkan dengan cara di centrifuge. Sesuai dengan permintaan pihak karantina Jepang, sera dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 700C selama 1 menit untuk membebaskan sera tersebut dari kemungkinan adanya virus Avian Influensa (AI). Kemudian disimpan pada suhu -200C, sampai saatnya dibawa ke Jepang.

Prosedur pemeriksaan ELISA:
Plat mikro ELISA 96 sumuran di Coat selama 16 jam pada suhu 4 0 C dengan antigen ND diencerkan dalam larutan penyangga karbonat-bikarbonat ph 9,6. Antigen virus ND yang digunakan adalah vaksin ND yang mengandung virus tipe B1 (produksi Research Institut for Chemical and Lymph Treatment Japan.) dengan perbandingan 2,4 ml vaksin : 9,6 ml buffer. Setelah diinkubasi pada suhu 4 0 C selama 16 jam, plat mikro dicuci 3 kali dengan Elisa washing buffer (0,01 % Triton –X-100 dalam PBS). Semua sumuran dalam plat mikro selanjutnya diblok dengan 200 ml susu skim 3 % dalam PBS. Plat mikro diinkubasikan selama 1 jam pada suhu 37 0 C dan dicuci sebanyak tiga kali seperti diatas. Ke dalam setiap sumuran kemudian ditambahkan serum itik yang diuji dengan pengenceran 1:200 (1 serum : 200 PBS).
Sebagai kontrol positif dipakai serum itik sampel yang positif dengan uji western imunoblotting. Sebagai kontrol negatif dipakai 2 sumuran yang diisi FCS (fetal calf serum ), 2 sumuran yang tidak diisi antibodi I dan 1 sumuran yang tidak diisi antibodi I dan II .
Setelah inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 0 C dan pencucian sebanyak 3 kali ke dalam sumuran plat mikro ditambahkan antiduck Ig G (KPL ) yang dilabel dengan horse radish peroxidase (HRP). Selanjutnya plat mikro diinkubasi kembali selama 1 jam pada suhu37 0 C, kemudian dicuci sebanyak tiga kali seperti diatas. Sesudah itu kedalam masing-masing sumuran ditambahkan 100 ml substrate solution (0,04% OPD dan 0,003 % H202 dalam Phospate Citrate buffer) dan diinkubasikan pada suhu kamar di tempat yang gelap tanpa dibungkus. Akhirnya ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 50 ml stop solution (H2SO4 6 N ).Perubahan warna menjadi coklat menandakan sampel tersebut positif.
Hasil dibaca secepatnya pada Elisa plate reader dengan panjang gelombang 490 nm. Nilai optical density ( OD ) yang didapat kemudian ditabulasi..

Uji Western Imunoblotting
Protein ND dianalisis dengan Sodium Duodecyl Sulfate-Polycrylamide Gel Elektrophpresis (SDS-Page) dengan 4% stacking gel dan 12,5 % separating gel. Protein yang telah terpisah ditransfer ke membran nitroselulosa, kemudian dibloking dengan susu skim 3% dalam PBS. Kemudian menbran digenangi dengan serum itik yang akan diuji dengan pengenceran 1:200. Setelah itu ditambahkan anti duck Ig G-HRP (Cappel), protein yang bereaksi divisualisasikan dengan penambahan substrat ECL(Amersham).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pemeriksaan antibodi ND dalam serum itik Bali dengan uji ELISA menunjukkan bahwa hasil positif ditemukan pada sebagian besar sample yang diperiksa (91.6%). Hasil positipditandai dengan perubahan substrat OPD dari bening sedikit kekuningan menjadi coklat kekuningan. Perubahan warna substrat ditemukan juga pada serum kontrol positip tetapi tidak pada kontrol negatip (Gambar 1)
Perubahan warna muncul karena pada mikroplat yang berisi serum yang mengandung antibodi ND terjadi ikatan antigen-antibodi. Ikatan ini kemudian terlacak dengan antiduck-IgG yang dilabel dengan enzim horse radish peroksidase
Enzim inilah yang mengubah OPD dari bening kekuningan menjadi coklat kekuningan. Tingkat kepekatan warna coklat dibaca dengan multiscan spectrophotometer dan dinyatakan dalam kerapatan optis (Optical Density/OD). Makin pekat intensitas warna coklat makin tinggi nilai OD-nya dan makin tinggi pula titer antibodi ND dalam serum yang diperiksa.
Dalam penelitian ini serum dinyatakan positif mengandung antibodi ND bila OD-nya sekurang-kurangnya 3 kali nilai OD rata-rata kontrol negatif. Kriteria ini dipakai karena pada uji western immunoblotting, hasil positip bila nilai OD pada uji ELISA sekurang-kurangnya 3 X nilai OD kontol negatif (gambar 2)

Gambar 1. Hasil Uji Elisa Serum Itik terhadap antigen Virus ND. Plat mikro Elisa di “coat” dengan antigen ND,ditambahkan serum itik. Ikatan antigen-antibodi dilacak dengan goat antiduck –HRP dan divisualisasikan dengan substrat OPD. Hasil positif ditandai dengan warna coklat, hasil negatif tidak berwarna

Berdasarkan kriteria itu sebanyak sebanyak 109 (91,6%) dari 119 sampel serum itik Bali dinyatakan positip mengadung antibodi ND (Tabel 1). Berdasarkan kelompok umur, diperoleh hasil bahwa hasil positip ELISA itik Bali muda (umur 2-3 bulan) adalah sebesar 86,4% dan pada itik dewasa (umur 6 bulan atau lebih )sebesar92,8%.
Ada kecenderungan bahwa antibody ND lebih banyak ditemukan pada itik dewasa jila dibandingkan itik muda. Namun analisis statistik dengan uji X2 dipreoleh hasil yang tidak berebeda nyata (p>0,01).

Tabel 1. Hasil pemeriksaan serum dengan ELISA .Jumlah ayam yang positif (OD ³0,12) dan negatif (OD0,01)

Pada uji westernimmunoblotting, hasil positip ditandai dengan andanya “band” khas virus ND yang bereaksi dengan serun itik (gambar 2) Hasil positip ditemukan pada serum yang positip pada uji ELISA. Oleh karena itu uji ini memperkuat hasil uji ELISA dan sekaligus membuktikan bahwa antibodi yang terdapat pada serum itik adalah antibodi ND.

Gamb 2.Profil Western Immunoblotting serum itik terhadap antigen virusND
Protein virus ND dianalisis dengan SDS-PAGE, ditransfer ke membran nitroselulose, direaksikan dengan serum itik. Reaksi antigen-antibodi divisualisasikan dengan penambahan antiduck IgG-HRP dengan substrat ECL
Keterangan: M = marker; 1. ND vaccine 10 µl ; 2. Sampel serum positif dengan nilai OD 2,247; 3 dan 5 Sampel serum negatif OD

Keberadaan antibodi ND dalam serum itik Bali ini menunjukkan bahwa itik pernah terinfeksi virus ND. Infeksi ND pada itik yang dipakai dalam penelitian ini sangat mungkin terjadi secara alami mengingat sampai saat ini belum pernah dilakukan vaksinasi ND pada itik Bali.
Penularam virus ND pada itik sangat mungkin terjadi melalui kontak langsung antara itik dan ayam yang dipelihara secara bersama-sama. Penularan ini dimungkinkan karena ND di Indonesia bersifat endemic dan secara klinis umumnya ditemukan pada ayam yang tidak kebal terhadap ND (Sudardjat, 1990) Sementara itu, infeksi virus ND pada unggas air dari familia Anahdae termasuk itik juga pernah dilaporkan (Lancaster dan Alexander,1972)
Meskipun belum ada laporan yang menyatakan adanya kesamaan virus penyebab ND pada ayam dan itik (secara molekuler dan taksonomik), hal ini perlu dicermati mengingat sulitnya pembrantasan kasus ND pada ayam di Bali.

KESIMPULAN
Itik Bali dapat terinfeksi ND dan tidak ada perbedaan prevalensi antara kelompok umur muda dan dewasa

DAFTAR PUSTAKA:
Huang Z, S Krisnamurthy, A Panda and S K Samal. 2003. Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and function as an alpa interferon antagonist. J. of Virology. Vol. 77, No.16 p 8676-8685

Huang Z., A Panda.,S Elankumaran.,D Govindarajan, D.Rockemann and SK Samal.2004. The Haemaglutinin Neurominidase Protein of Newcastle disease virus Determines Tropism and virulence. J. of Virology. Vol 78,NO.8 pp4176-4184

Lancaster,J.E and DJ Alexander. 1975. Newcastle Disease. Virus and Spread. A Review of Some of the literature. Canadian Departement of Agriculture p.1-68

OIE,2000.Newcastke Disease: Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccine.Paris,office international des epizooties pp.161-163.

Sudarjat,S. 1990. Epidemiologi Veteriner Terapan.. Jilid I.Direktorat Bina Kesehatan Hewan. Direktorat Jendral Peternakan.

Sudarjat,S. 1996. Peranan Vaksinasi Newcastle Disease (ND) terhadap peningkatan populasi dan produksi ayam buras serta dampaknya ditinjau dari sudut ekonomi veteriner. Poultry Indonesia 194:28

Suardana,W dan N. Suarsana, 2003. Status kepemilikan hewan pada keluarga di pedesaan (belum dipublikasi).

Young,M., R. Alders,., S. Grimes., P. Spradbrow., P. Dias., A. da Silva,A. and Q. Lobo. 2002. Controlling Newcastle Disease in Village Chickens: Laboratory Manual.ACIAR,GPO Box 1571 Canbera,ACT.2601.pp10-13